潘彩燕，林曉堅(jiān)，袁兆偉，張蓉，劉剛，謝娟

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省人民醫(yī)院 藥劑科，貴州 貴陽 550002；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

牛蒡子(ArctiumlappaL)為菊科植物牛蒡的干燥成熟果實(shí)，是中醫(yī)常用的一味中藥[1]。牛蒡苷元(Arc-G)為木脂素類化合物，是牛蒡子中一類主要的活性物質(zhì)。研究表明，Arc-G具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗心律失常、擴(kuò)張血管及降低血糖等藥理作用[2-13]，還具有抗血小板活化因子的作用[14]，但關(guān)于Arc-G抗血栓作用的報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察Arc-G對正常小鼠血液成分和斷尾出血時(shí)間的影響，同時(shí)采用角叉菜膠誘發(fā)小鼠尾部血栓形成及凝血酶誘導(dǎo)體外血栓形成、觀察Arc-G對血栓形成的影響，探討Arc-G的抗血栓作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物 清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為18～22 g，貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號SCXK(黔)2018-0001]。

1.1.2藥品與試劑 Arc-G(麥克林試劑公司，批號18092808)，角叉菜膠(Sigma，批號CBG5890V)，凝血酶(Sigma公司, 批號LBV2136)，纖維蛋白原(Sigma公司, 批號SLBS4238)，司匹林腸溶片(大同市利群藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號170605)。

1.1.3儀器 XS205型萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多科學(xué)儀器公司)，HK-UP-20分析型超純水機(jī)(合肥宏科科技有限公司)，全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，RAC-1830全自動(dòng)凝血分析儀(美國Rayto公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠斷尾出血時(shí)間[15]取32只昆明小鼠，隨機(jī)均分為空白對照組(生理鹽水)、阿司匹林組(100 mg/kg)、Arc-G低劑量組(12.5 mg/kg)和Arc-G高劑量組(50 mg/kg)，按給藥體積0.1 mL/10 g腹腔注射給藥，1次/d、連續(xù)7 d；末次給藥30 min時(shí)，在距離小鼠尾尖4 mm處剪斷，用濾紙吸取第1滴血，立即將小鼠尾巴垂直置于37 ℃ 生理鹽水中，記錄小鼠尾巴出血時(shí)間；血流停止后繼續(xù)觀察1 min，如果1 min內(nèi)停止流血，則把血流停止時(shí)刻記為停止時(shí)間；若停止流血后1 min 內(nèi)又復(fù)流，則繼續(xù)記錄，直到15 min還未停止，則出血時(shí)間記為15 min。

1.2.2血小板計(jì)數(shù)及血小板平均體積檢測 取32只昆明小鼠，分組給藥同1.2.1；末次給藥30 min時(shí)，下腔靜脈取血，肝素抗凝，全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀對血小板數(shù)目和血小板平均體積(MPV)進(jìn)行分析。

1.2.3凝血4項(xiàng)檢測 取32只昆明小鼠，分組給藥同1.2.2；末次給藥30 min時(shí)，下腔靜脈取血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝，全自動(dòng)凝血儀檢測凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)和纖維蛋白原(FIB)。

1.2.4小鼠尾部血栓模型的制備[16]取40只昆明小鼠，分組給藥同1.2.1。末次給藥30 min時(shí)，各組小鼠均腹腔注射角叉菜膠溶液(20 mg/kg)造模，正常飲食，24 h時(shí)用游標(biāo)卡尺測量小鼠尾巴長度及黑尾長度，黑尾比率(%)=黑尾長度/鼠尾總長度×100%，以黑尾比率表示血栓形成率。

1.2.5斑塊回縮實(shí)驗(yàn)[17]取10只25～30 g的健康昆明種小鼠，4%水合氯醛麻醉，下腔靜脈取血制備小鼠洗滌血小板，加入適量PPP重懸血小板，調(diào)整數(shù)目至2×1011個(gè)/L，室溫靜置1 h。取3 mL 洗滌血小板分裝到2 mL離心管中，500 μL/管，分為空白對照組(生理鹽水5 μL)、模型組(生理鹽水5 μL)、替羅非班組(替羅非班5 μL，終濃度為0.5 mg/L)、溶劑對照組(5%DMSO 5 μL)、Arc-G低劑量組(終濃度為3.125 μmol/L)及Arc-G高劑量組(終濃度為12.5 μmol/L)，各管分別加入CaCl25 μL(終濃度為1 mmol/L)、纖維蛋白原 10 μL(20 g/L)，輕柔混勻，除空白對照組外，各管分別加入凝血酶 5 μL(終濃度為20 000 U/L)，輕柔混勻，置于37 ℃水浴鍋內(nèi)反應(yīng)，并在 30 min 時(shí)觀察并拍照。用Image J軟件計(jì)算血塊回縮的面積、血塊回縮比率[血塊回縮比率(%)=(血塊面積/血塊回縮前面積)×100%]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 斷尾出血時(shí)間

與空白對照組比較，阿司匹林組和Arc-G高劑量組可以顯著延長小鼠斷尾出血時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Arc-G低劑量組也使小鼠的平均出血時(shí)間延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：與模型組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

2.2 血小板計(jì)數(shù)及血小板平均體積

連續(xù)腹腔注射Arc-G和阿司匹林7 d，與空白對照組比較，各組小鼠血小板數(shù)目、MPV比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 Arc-G對小鼠血小板計(jì)數(shù)和MPV的影響

2.3 PT、APTT、TT及FIB

與空白對照組比較，阿司匹林組顯著延長小鼠APTT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但對PT、TT、FIB的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Arc-G對小鼠PT、APTT、TT及FIB差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 Arc-G對小鼠PT、APTT、TT及FIB的影響

2.4 靜脈血栓

與空白對照組相比較，Arc-G高劑量組可顯著減少由角叉菜膠引起的小鼠尾部血栓形成率(P<0.05)；低劑量也可減少小鼠黑尾比率，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

注：(1)與模型組比較，P<0.01。

2.5 體外血栓及血塊回縮實(shí)驗(yàn)

與空白對照組比較，Arc-G低劑量、Arc-G高劑量或替羅非班均可明顯抑制血塊回縮，且高劑量Arc-G比低劑量Arc-G效果更佳(圖3)；與溶劑對照組比較，Arc-G低劑量、Arc-G高劑量可抑制血塊回縮(P<0.05，表3)。

圖3 Arc-G對斑塊回縮實(shí)驗(yàn)的影響

表3 Arc-G對血塊回縮比率的影響

3 討論

血小板數(shù)目、血小板功能及凝血系統(tǒng)是影響止血功能的主要因素。本研究建立小鼠斷尾出血時(shí)間測定模型觀察Arc-G對小鼠止血功能的影響，間接評價(jià)Arc-G對血小板功能的作用。本實(shí)驗(yàn)測定小鼠斷尾出血時(shí)間結(jié)果提示，Arc-G和阿司匹林均能顯著延長小鼠的尾巴出血時(shí)間；血液學(xué)分析結(jié)果提示，Arc-G對血小板數(shù)目、MPV的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；另外，血液凝血4項(xiàng)的測定結(jié)果提示，Arc-G對PT、APTT、FIB、TT的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；因此，Arc-G可能是通過影響血小板功能延長小鼠的止血時(shí)間。

角叉菜膠是從紅藻類海草中提取出來的硫酸多糖，能夠誘導(dǎo)機(jī)體釋放出白介素-1、腫瘤壞死因子等炎癥物質(zhì)[18]，引起炎癥反應(yīng)發(fā)生。這些炎癥介質(zhì)可對正常內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致炎細(xì)胞趨化、浸潤，使凝血系統(tǒng)被激活，從而影響血小板活化、凝血系統(tǒng)等相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，可誘導(dǎo)小鼠尾部形成血栓。角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠尾部血栓模型成功率高，操作簡單，易于重復(fù)，對小鼠損傷較小，且易于觀察和測量[19]，該模型已廣泛應(yīng)用于評價(jià)功能性食品的抗血栓作用。血栓的形成過程復(fù)雜，與血小板的活性、血管內(nèi)皮損傷等因素有關(guān)[20]。其中，血小板在血栓形成過程中起關(guān)鍵作用。血塊回縮是由于凝血酶激活血小板，催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，形成穩(wěn)定凝塊，反映了血小板在體外形成穩(wěn)固血栓的過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Arc-G(50 mg/kg)可以顯著減少角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠尾部血栓的形成，能夠抑制凝血酶誘導(dǎo)的血塊回縮。

綜上所述，Arc-G延長小鼠尾巴出血時(shí)間可能與其能夠影響血小板功能有關(guān)，Arc-G可能是通過影響血小板功能發(fā)揮抑制血栓形成的作用。本研究只是初步考察了Arc-G抗血栓的作用，其發(fā)揮抗血栓作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。