楊慶軍

喉癌占所有類型癌癥的1%～5%[1]，隨著發(fā)病率的增加，喉癌在耳鼻喉科惡性腫瘤中排名第三，占所有耳鼻喉科惡性腫瘤的7.9%～35%，并且90%為鱗狀細胞癌[2-3]。喉癌的發(fā)生機制目前仍有待闡明，相關研究表明，表皮生長因子受體(EGFR)和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)與腫瘤的發(fā)生、侵襲、淋巴結轉移、復發(fā)和預后生存率密切相關[4-5]。然而，EGFR和Cyclin D1在喉癌中的相關性及其在喉癌發(fā)生發(fā)展中是否具有協(xié)同作用尚未見報道，研究EGFR和Cyclin D1在喉癌中表達水平的相關性以及與患者臨床特征的關系，有助于闡明喉癌的生物學特征。本研究通過使用免疫組織化學染色和統(tǒng)計分析確定EGFR和Cyclin D1在喉癌組織中的表達與疾病臨床特征之間的關聯(lián)，為評估喉癌的嚴重程度和選擇最合適的治療方案提供幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015年至2019年我院耳鼻喉科手術采集的46例原發(fā)性喉鱗狀細胞癌(LSCC)和20例聲帶息肉(VCP)石蠟包埋組織標本，分別作為研究組和對照組。LSCC患者均使用電子喉鏡及病理學檢查確定腫瘤分期，并采用第8版國際喉癌控制淋巴結轉移分期系統(tǒng)(TNM)分期[6]，T1～T2期19例(41.30%)，T3期22例(47.83%)，T4期5例(10.87%)。治療前無頸淋巴結轉移43例(93.48%)，頸部淋巴結轉移3例(6.52%)，均為N1期。治療后復發(fā)或轉移28例(60.87%)。所有LSCC患者均行手術治療，包括喉部分切除術、全喉切除術和頸淋巴結清掃術。T4期和部分T3期患者采用鈷-60放射治療或5-氟尿嘧啶+順鉑化療作為輔助治療，所有病例隨訪5年以上。

1.2 免疫組織化學染色方法

使用Super Vision IHC試劑盒(武漢博斯特生物科技有限公司)將標本進行免疫組織化學(IHC)染色。樣品在4 ℃下用4%多聚甲醛固定約24 h，通過分級乙醇脫水，用二甲苯洗滌并包埋在石蠟中。然后5 μm連續(xù)切片，在二甲苯和降醇系列中進行常規(guī)脫蠟和再水化，并在去離子水中沖洗。內源性過氧化物酶用去離子水中的3%過氧化氫淬滅。用pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液在98℃下孵育10 min，然后與10%山羊血清封閉溶液(武漢博士德生物科技有限公司)在室溫下孵育20 min，抗EGFR抗體(OriGene Technologies)，Cyclin D1(福州邁欣生物科技有限公司)在4 ℃下過夜。用PBS洗滌兩次后，將辣根過氧化物酶結合兔抗免疫球蛋白G抗體在37℃中孵育30 min。 3,3'-二氨基聯(lián)苯胺染色后，切片在室溫下用蘇木精復染2 min，脫水并貼在蓋玻片上。

1.3 成果評估

細胞核、細胞質或細胞膜中的黃色、棕色及褐色染色為EGFR和Cyclin D1陽性信號。半定量評分分析：隨機選取5個高倍視野(×200)，使用光學顯微鏡觀察各視野計數(shù)細胞總數(shù)和陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞百分比。陽性細胞百分比評分：0分：<25%陽性細胞；1分：25%～49%陽性細胞；2分：50%～74%陽性細胞；3分：≥75%陽性細胞。染色強度評分：0分：無顯色；1分：淺黃色；2分：橙色；3分：棕褐色。最后通過上述兩種評分相加獲得最終分數(shù)，然后將其除以2。將結果定義為：0分：陰性(-)；0.5～1.0分：弱陽性(+)；1.5～2.0分：陽性(++)；2.5～3.0分：強陽性(+++)。陰性和弱陽性表達定義為低表達；陽性和強陽性表達定義為高表達。評估患者2年總生存率以及EGFR和Cyclin D1表達與患者生存率的關系。

1.4 統(tǒng)計分析

使用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，χ2檢驗分析喉癌患者的性別、年齡、臨床分期、治療后轉移狀況與基因表達的關系。用spearman相關分析基因表達水平之間的關系。采用對數(shù)秩檢驗(Log Rank Test)比較各組生存率，并使用Kaplan-Meier曲線進行喉癌患者的生存分析，以評價EGFR和Cyclin D1表達水平與患者生存率的相關性。所有檢驗均為雙尾，以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EGFR和Cyclin D1染色結果

棕色染色的EGFR主要位于喉癌細胞的細胞膜和細胞質中。棕褐色染色的Cyclin D1主要位于喉癌細胞的細胞核中，聲帶息肉組織中EGFR和cyclin D1的表達很低。

EGFR和Cyclin D1在喉癌組織中的高表達率分別為71.7%(33/46)和52.2%(24/46)，在聲帶息肉中的高表達率分別為10.0%(2/20)和5.0%(1/20)。喉癌組織和聲帶息肉組織中EGFR和Cyclin D1表達水平差異有統(tǒng)計學意義(χ2=21.332、13.183，P均<0.001)。

2.2 EGFR和Cyclin D1與臨床特征的關系

EGFR和Cyclin D1的表達水平與喉癌臨床分期和治療反應密切相關(P均<0.05)，EGFR和Cyclin D1的表達與患者年齡無關(P>0.05)，見表1。

表1 EGFR、Cyclin D1表達與喉癌臨床特征的關系(例，%)

2.3 喉癌組織中EGFR和Cyclin D1表達的相關性

EGFR和Cyclin D1在喉癌組織中的表達呈正相關(γ=0.356，P=0.015)，見表2。

表2 喉癌組織中EGFR與Cyclin D1的相關性/例

2.4 喉癌臨床特征及組織中EGFR和Cyclin D1的表達與患者生存率的關系

使用Kaplan-Meier曲線進一步分析EGFR和Cyclin D1表達水平與患者生存率的相關性，結果顯示 ，喉癌患者生存率與EGFR(χ2=4.261，P=0.039)和Cyclin D1(χ2=6.219，P=0.013)的表達水平有關，見圖1。

圖1 EGFR和Cyclin D1的表達與患者生存率的相關性

2.5 喉癌患者生存率的COX回歸分析

COX回歸分析表明，治療后復發(fā)或轉移與患者較差的生存率密切相關(P<0.001)。較高的TNM分期與患者較差的生存率密切相關，TNMⅠ～Ⅱ 期P=0.001，TNM Ⅲ期P=0.017，TNM Ⅳ期P<0.001。見表3。

表3 喉癌患者生存率的COX回歸分析

3 討論

EGFR是一種配體介導的多功能跨膜糖蛋白，存在于除人體造血系統(tǒng)外的大多數(shù)組織的細胞膜上，EGFR對EGF有很高的親和力，這種相互作用具有時間和溫度依賴性、飽和性和可逆性[7]。EGFR激活酪氨酸激酶后，通過RAS-RAF-MEK-MAPK、PI3K-PKC-IKK和JAK-STAT通路實現(xiàn)信號轉導的級聯(lián)放大，將細胞外有絲分裂信號傳遞到細胞內，從而調節(jié)正常細胞生長、分化，并促進細胞損傷修復。EGFR 在許多實體瘤中高度表達，并且與腫瘤進展、細胞凋亡、血管生成和轉移密切相關[8-9]。體外和體內實驗表明，EGFR是喉癌發(fā)生發(fā)展的重要抗癌靶點，抑制EGFR可以限制喉鱗狀細胞癌的生長，此類藥物在與其他藥物聯(lián)合使用時可增強它們的抗癌作用[10-11]。本研究結果表明，與聲帶息肉組織相比，喉癌中EGFR表達顯著增加。此外，在較高TNM分期的組織中發(fā)現(xiàn)EGFR表達增加，喉癌治療后復發(fā)或轉移的患者中EGFR表達(88.9%)顯著高于未出現(xiàn)復發(fā)轉移者(60.7%)，說明EGFR表達可能促進喉癌細胞的侵襲和轉移。

Cyclin D1與CDK4或CDK6相互作用以誘導細胞周期從G1期進展到S期并促進細胞分裂或轉化[12]。Cyclin D1的異常表達可能導致細胞周期失衡，從而導致腫瘤發(fā)生[13]。先前的研究證實Cyclin D1與惡性腫瘤的演變密切相關[14]。使用 LSCC異種移植模型的體內研究表明，Cyclin D1下調可以抑制腫瘤細胞生長并誘導細胞凋亡[15]。在本研究中，與聲帶息肉組織相比，喉癌組織中Cyclin D1的表達水平顯著升高。此外，較高的TNM分期與Cyclin D1的高表達相關，喉癌治療后復發(fā)或轉移的患者中Cyclin D1的表達(60.0%)較未復發(fā)或轉移的患者(29.2%)顯著增加，表明Cyclin D1可能在喉癌的侵襲和轉移中起一定作用。

本研究結果表明，喉癌組織中EGFR和Cyclin D1的表達水平均明顯高于聲帶息肉組織，且與喉癌的TNM分期及治療后的復發(fā)轉移密切相關。這兩種因子在喉癌中的表達水平呈正相關，表明EGFR和Cyclin D1可能具有協(xié)同作用，該作用的機制可能為EGFR激活RAS/Raf通路，通過MAPK途徑誘導Cyclin D1的表達和激活，從而促進細胞周期進入S期并啟動增殖。然而，有研究表明EGFR和Cyclin D1在喉癌中的表達無明顯相關性[16]，其原因可能是EGFR和Cyclin D1只是參與癌變過程的眾多復雜細胞信號通路的一部分，在喉癌的發(fā)生和發(fā)展過程中，這些信號通路具有不同的表達階段。用Cox回歸模型對生存率進行分析，發(fā)現(xiàn)較高的TNM分期和治療后復發(fā)轉移與喉癌患者較差的生存率密切相關。不同TNM分期患者的生存率有顯著差異，提示喉癌的臨床分期和治療反應是影響生存率的獨立危險因素，而EGFR和CyclinD 1高表達是影響生存率的相對危險因素。

綜上所述，EGFR和Cyclin D1的表達水平與患者臨床分期密切相關，其異常表達可能促進喉癌細胞的生長和侵襲，促進腫瘤的復發(fā)或轉移，從而影響患者的生存率。臨床上可通過檢測EGFR和Cyclin D1基因的表達來判斷患者生存率，結合特異性靶向EGFR和Cyclin D1基因重組治療可減少腫瘤殘留，防止復發(fā)或轉移。本研究的主要局限性是男女比例為45∶1，盡管LSCC在男性中更為普遍，但依舊高于以前的研究[17]?？赡苁怯捎趩沃行牡牟±龜?shù)量相對較少造成的，未來應該進行多中心的研究。