柯心如，劉登艷，譚建彬，蘇 琦，李 亞

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】植物寄生線蟲是植物侵染性病害的主要病原物之一，每年給世界各地的主要經(jīng)濟(jì)作物造成高達(dá)1 570 億美元損失，其中根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）是為害最嚴(yán)重的植物寄生線蟲，由于其分布廣泛、寄主眾多，已成為威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要病原［1］。目前對(duì)根結(jié)線蟲的防治主要以化學(xué)藥劑防治為主，但該防治方法生產(chǎn)成本較高，對(duì)環(huán)境造成污染，同時(shí)也對(duì)人畜健康存在潛在威脅［2］。而生防制劑作為一種環(huán)境友好的化學(xué)藥劑替代品逐漸引起人們的重視，可通過充分利用線蟲天敵的生防手段來防治植物線蟲。而淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）能有效防治根結(jié)線蟲，是一種極具推廣潛力的習(xí)居菌和功能菌［3-4］。研究表明，淡紫紫孢菌可用于防治馬鈴薯、番茄、小麥及香蕉等幾十種經(jīng)濟(jì)作物的線蟲病，且防效與進(jìn)口的化學(xué)殺線蟲藥相當(dāng)或接近，成本較低，不污染農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境［5-8］。因此，探究不同培養(yǎng)條件對(duì)淡紫紫孢菌生長(zhǎng)特性的影響，對(duì)充分挖掘該菌的生防潛能具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】淡紫紫孢菌原名為淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus），最初由Jatala 于1979 年在南方根結(jié)線蟲卵中分離獲得［9-10］。該菌能通過分泌菌絲寄生根結(jié)線蟲的蟲卵或通過分泌幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶降解線蟲表皮的幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)成分，從而入侵并破壞細(xì)胞成分，對(duì)根結(jié)線蟲幼蟲具有毒殺作用［11］。然而，國內(nèi)外對(duì)擬青霉屬真菌研究較少，對(duì)抗線蟲的防治主要集中在侵染機(jī)制等方面。楊凡等［12］測(cè)定了淡紫紫孢菌pt361 對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲卵的寄生率、幼蟲致死率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pt361 菌株對(duì)線蟲蟲卵的寄生率為72.6%，其菌株混合發(fā)酵液對(duì)幼蟲的致死率達(dá)95.2%。Gine 等［6］研究抗性番茄與淡紫紫孢菌PI251 菌株組合對(duì)抗南方根結(jié)線蟲的有效性，結(jié)果表明該菌在體外條件下可寄生94.5%根結(jié)線蟲的蟲卵。同時(shí)，也有部分學(xué)者對(duì)該菌的生長(zhǎng)特性等進(jìn)行研究，例如，范瑞琦等［13］從為害海南省茄子根結(jié)線蟲雌蟲體內(nèi)分離的淡紫紫孢菌最適培養(yǎng)基為PDA，最佳生長(zhǎng)溫度和產(chǎn)孢溫度均為28℃，最適pH 為7.0，完全黑暗條件更有利于菌株生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，大多數(shù)研究主要集中于淡紫紫孢菌與根結(jié)線蟲的互作機(jī)制及該菌生長(zhǎng)特性等方面，但針對(duì)不同環(huán)境對(duì)淡紫紫孢菌發(fā)酵所產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶的相關(guān)研究報(bào)道極少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】確定適合淡紫紫孢菌生長(zhǎng)、產(chǎn)蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的最適溫度和pH 值，以及常見氮源和碳源物質(zhì)，幫助菌株建立最佳生長(zhǎng)和收獲條件，以達(dá)到最大生防活性，為該菌大量繁殖作為生物防治劑的后續(xù)研究及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為具有柑橘粉虱座殼孢子座的紅江橙樹葉片，于2017 年12 月份采集自廣東廉江紅江農(nóng)場(chǎng)的橙樹果園。

供試培養(yǎng)基：（1）PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL；（2）PDA 液體培養(yǎng)基以不加瓊脂配置。上述培養(yǎng)基均于121℃高壓滅菌20 min 后備用。

主要試劑：細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 菌株分離純化

將柑橘粉虱座殼孢子座用無菌水沖洗后，經(jīng)75%乙醇浸泡30 s，轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液中浸泡30 s，然后用無菌水清洗3～5 次。把表面消毒好的子座研磨后放入1.5 mL 離心管中，加入1 mL無菌水制成孢子懸浮液，取100 μL 接種于含有利福平的PDA 培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌絲或菌落后，挑取具有典型菌落特征的單菌落進(jìn)行純化，獲得編號(hào)為ZJPL1812 的菌株，將純化后的菌株接種于試管斜面，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)鑒定 從純化ZJPL1812 菌株的單菌落中取直徑0.5 cm 的菌餅接于PDA 平板中央，培養(yǎng)7 d 后觀察菌落外觀特征，并通過光學(xué)顯微鏡觀察菌絲、分生孢子梗以及分生孢子的形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》［14］進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3.2 分子鑒定 參照White 等［15］設(shè)計(jì)的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCT-TATTGATATGC-3′）進(jìn)行真菌的rDNA-ITS 序列擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系共50 μL，反應(yīng)條件為：96℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s、55℃復(fù)性30 s、72℃延伸60 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR 完成后取5 μL 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓120 V，電泳25 min，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察目的條帶。將目的條帶的PCR 產(chǎn)物送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序。利用NCBI Blast 進(jìn)行序列比對(duì)，并采用MEGA11 通過Neighbor-Joining 算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株生物學(xué)特性研究

1.4.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 供試菌株在PDA 平板上培養(yǎng)7 d 后，加入10 mL 無菌水，刮取孢子絲和孢子制成菌懸液，用雙層紗布過濾制成孢子懸浮液，將孢子懸浮液濃度調(diào)整至1×109個(gè)/mL 備用。

（1）溫度：將1 mL 孢子懸浮液加入100 mL PDA 液體培養(yǎng)基中，分別在10、15、20、25、30、35℃條件下避光振蕩（180 r/min）培養(yǎng)，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

（2）pH 值：用0.1 mol/L HCl 和NaOH 溶液將100 mL PDA液體培養(yǎng)基pH值調(diào)至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，隨后分別加入孢子懸浮液1 mL，30℃下避光振蕩（180 r/min）培養(yǎng)，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

（3）氮源：以PDA 液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加5 g/L 的硝酸銨、硝酸鈉、精氨酸和磷酸二氫銨，配制成不同氮源的培養(yǎng)基。隨后在各類型氮源培養(yǎng)基中分別加入孢子懸浮液1 mL，30℃下避光振蕩（180 r/min）培養(yǎng)，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

（4）碳源：以PDA 液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以20 g/L 的蔗糖、麥芽糖、山梨醇和可溶性淀粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，配制不同碳源的培養(yǎng)基。隨后在各類型碳源培養(yǎng)基中分別加入孢子懸浮液1 mL，30℃下避光振蕩（180 r/min）培養(yǎng)，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

待測(cè)菌株在不同類 型培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d 后，將培養(yǎng)液于8 000 r/min 下離心20 min，過濾收集菌絲體，于60℃下干燥至恒重，并稱重。

1.4.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株蛋白酶活性的影響 待測(cè)菌株在1.4.1 不同類型培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，將培養(yǎng)液于8 000 r/min 下離心20 min，除去菌體取上清，其中的蛋白酶用(NH4)2SO4沉淀后再經(jīng)透析袋透析獲得粗酶液［16］。

標(biāo)準(zhǔn)曲線參照張龍翔等［17］的方法制作，蛋白酶活性的測(cè)定采用Folin-酚法［18］。測(cè)得的吸光值（OD）通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的酪氨酸濃度，根據(jù)公式計(jì)算出酶活。以每毫升樣品在40℃下每分鐘催化分解酪蛋白生成1 μg 酪氨酸的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

蛋白酶活力（U/mL）=K1×△A680×N×4/10

式中，K1 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得光密度為1 時(shí)對(duì)應(yīng)的酪氨酸濃度；△A680 為OD680樣品-OD680對(duì)照；N 為酶液稀釋倍數(shù)；4 表示2 mL 反應(yīng)液中取0.5 mL 進(jìn)行顯色反應(yīng)；10 表示反應(yīng)時(shí)間為10 min。

1.4.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株幾丁質(zhì)酶活性的影響 待測(cè)菌株在1.4.1 不同類型培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d 后，將培養(yǎng)液于8 000 r/min 下離心20 min，除去菌體取上清，經(jīng)0.45 μm 的混合纖維素膜過濾后制成粗酶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線參照鄧彩萍等［19］的方法制作，幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定采用DNS（3,5-二硝基水揚(yáng)酸）法［20］。測(cè)得的OD 值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)的NAG（N-乙酰氨基葡萄糖）濃度，根據(jù)公式計(jì)算出酶活。以每毫升發(fā)酵液每分鐘水解脫乙酰膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μg NAG 的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

幾丁質(zhì)酶活力（U/mL）＝K2×△A530×N×2/60

式中，K2 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得光密度為1 時(shí)對(duì)應(yīng)的NAG 濃度；△A530 為OD530樣品-OD530對(duì)照；N 為酶液稀釋倍數(shù)；2 表示1 mL 反應(yīng)液中取0.5 mL 進(jìn)行顯色反應(yīng)；60 表示反應(yīng)時(shí)間為60 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件中的方差分析（ANOVA）和Duncan’s新復(fù)極差法分析差異顯著性，運(yùn)用GraphPad Prism 9.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖片繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ZJPL1812 的分離和純化

從廣東廉江紅江農(nóng)場(chǎng)采集的柑橘粉虱座殼孢子座如圖1 所示，肉質(zhì)子座多位于柑橘葉片背面，成熟的子座中間為橙黃色，邊緣呈黃色，與葉片連接處可見白色菌絲，子座中間乳突狀隆起，其中有多個(gè)不規(guī)則孔口，可分泌蜜汁或膠質(zhì)，從該子座中分離純化得到ZJPL1812 菌株。

圖1 柑橘粉虱座殼孢子座和純化的ZJPL1812 菌落形態(tài)Fig.1 Stroma of Aschersonia aleyrodis and colonies morphology of purified ZJPL1812

2.2 菌株ZJPL1812 的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 菌株ZJPL1812 在PDA 固體培養(yǎng)基上，初期菌絲白色、致密，表面無分泌物，菌落形態(tài)有同心輪紋狀（圖2A），也有呈分散狀態(tài)的絨毛狀（圖2B），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落中心由淡紫色逐漸變?yōu)榛液谏▓D2C）。

圖2 菌株ZJPL1812 的菌落形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of colonies of strain ZJPL1812

該菌株菌絲狹長(zhǎng)、無色、具分隔，產(chǎn)孢方式為內(nèi)壁芽生瓶梗式（圖3A），瓶梗基部有明顯膨大，頂端逐漸變細(xì)（圖3B、圖3C），分生孢子梗頂端多次輪生燒瓶狀產(chǎn)孢瓶梗，頂生分生孢子，分生孢子透明、串生，單個(gè)孢子橢圓形或近圓形、大小為2.5～3.2 μm×2.0～2.2 μm（圖3D）。

圖3 菌株ZJPL1812 的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of strain ZJPL1812

2.2.2 分子鑒定 利用通用引物ITS1 和ITS4 對(duì)分離得到的ZJPL1812 菌株DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)電泳分析獲得1 條約500 bp 的條帶（圖4）。經(jīng)序列測(cè)定，片段大小為376 bp。將ZJPL1812菌株的ITS 序列在NCBI 中進(jìn)行Blast 比對(duì)分析，結(jié)果顯示該菌株與GenBank 中多個(gè)淡紫紫孢菌菌株（Purpureocillium lilacinum，登錄號(hào)：MH483735.1、MH483859.1、MH483660.1）的 同源性為99%～100%。通過MEGA11 軟件進(jìn)行相關(guān)分析并構(gòu)建系 統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明ZJPL1812菌株與多個(gè)淡紫紫孢菌（P.lilacinum）聚在一支（圖5），結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將ZJPL1812 菌株鑒定為淡紫紫孢菌（P.lilacinum）。

圖4 菌株ZJPL1812 ITS 區(qū)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoretogram of PCR amplification results in ITS region of strain ZJPL1812

圖5 基于rDNA-ITS 序列構(gòu)建的菌株ZJPL1812 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain ZJPL1812 constructed based on rDNA-ITS sequence

2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ZJPL1812 生物量的影響

溫度對(duì)菌株ZJPL1812 的生物量積累具有顯著影響，不同溫度處理間差異顯著（圖6A），當(dāng)溫度為10℃時(shí)菌絲幾乎不生長(zhǎng)，15～35℃范圍內(nèi)菌絲均能生長(zhǎng)，但在15、35℃條件下菌絲生長(zhǎng)受到明顯抑制，30℃時(shí)菌絲干質(zhì)量最大、達(dá)到3.4 g/L?？梢姡摼曜钸m培養(yǎng)溫度為30℃，該溫度下的菌株生長(zhǎng)情況與其他培養(yǎng)溫度相比均達(dá)到顯著差異。不同pH 值對(duì)該菌株生長(zhǎng)的影響結(jié)果（圖6B）表明，該菌株能耐受較廣的酸堿度范圍，在pH 5.0～9.0 范圍內(nèi)均生長(zhǎng)良好，各處理間菌絲體干質(zhì)量無顯著差異，在pH 3.0 和pH 11.0 條件下生長(zhǎng)相對(duì)較差、生物量積累較少。該菌株在供試的7 種不同氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)不同（圖6C），對(duì)不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d 后的菌絲體干質(zhì)量測(cè)定結(jié)果顯示，以硫酸銨、磷酸二氫銨為氮源的培養(yǎng)基菌絲體干質(zhì)量最大，分別可達(dá)1.585、1.667 g/L，但二者之間無顯著差異；隨后依次為蛋白胨、精氨酸和硝酸胺，菌絲體干質(zhì)量分別為0.965、0.697、0.667 g/L；以硝酸鈉為氮源和無氮源條件下菌絲生長(zhǎng)較弱，表明以硫酸銨、磷酸二氫銨為氮源比較適合該菌株生長(zhǎng)。不同碳源培養(yǎng)基對(duì)該菌株的生物量積累差異顯著（圖6D），其中在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲體干質(zhì)量最大達(dá)3.013 g/L，且與其他供試碳源之間差異顯著；可溶性淀粉和山梨醇次之，菌絲體干質(zhì)量分別為1.673、1.540 g/L；而以蔗糖、葡萄糖為碳源時(shí)長(zhǎng)勢(shì)最差，菌絲體干質(zhì)量低。

圖6 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ZJPL1812 生物量的影響Fig.6 Effects of different culture conditions on the biomass of strain ZJPL1812

2.4 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ZJPL1812 蛋白酶活性的影響

由菌株ZJPL1812 產(chǎn)生的蛋白酶在10～35℃均有活性，最適反應(yīng)溫度為25～30℃，酶活性分別可達(dá)0.47、0.63 U/mL，但差異不顯著；當(dāng)溫度在10～30℃時(shí)，蛋白酶活性隨溫度升高而上升、超過30℃迅速下降（圖7A）。在pH 值3.0～11.0 范圍內(nèi)，pH 為5.0、7.0 和9.0 時(shí)蛋白酶活性最高，分別為3.556、3.133、2.545 U/mL，三者之間差異不顯著；當(dāng)培養(yǎng)基pH 過高或過低（pH 為11.0或3.0）時(shí)，蛋白酶活性最低，分別為0.467、0.256 U/mL（圖7B）。可見，該菌株在中性、弱酸和弱堿環(huán)境條件下所產(chǎn)生的蛋白酶活性較高。菌株ZJPL1812 產(chǎn)生的蛋白酶在不同氮源培養(yǎng)基上活性不同，以蛋白胨為氮源時(shí)酶活性最高，其次為硫酸銨、精氨酸、硝酸鈉、硝酸銨，但在以磷酸二氫銨為氮源時(shí)蛋白酶活性極低，與不含氮源的培養(yǎng)基無顯著差異（圖7C）。不同碳 源對(duì)ZJPL1812 蛋白酶活性影響結(jié)果表明，以蔗糖為碳源時(shí)蛋白酶活性最高，麥芽糖、可溶性淀粉、山梨醇次之，而以葡萄糖作為碳源時(shí)長(zhǎng)勢(shì)最差、酶活性最低（圖7D）。

圖7 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ZJPL1812 蛋白酶活性的影響Fig.7 Effects of different culture conditions on the protease activity of strain ZJPL1812

2.5 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ZJPL1812 幾丁質(zhì)酶活性的影響

在溫度10～30℃范圍內(nèi)，該菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性隨溫度上升逐漸提高，至30℃時(shí)達(dá)到最大值0.910 U/mL，是10℃時(shí)幾丁質(zhì)酶活性的20 倍；隨著溫度上升幾丁質(zhì)酶活性開始下降，35℃時(shí)幾丁質(zhì)酶活性僅有30℃時(shí)的6 8%（圖8A）。可見，環(huán)境溫度小于10℃或高于35℃均會(huì)使該菌所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性降低。菌株ZJPL1812 在供試的5 種pH 條件下均有活性（圖8B），pH 5.0～7.0時(shí)酶活性較高，在pH 3.0 或pH 9.0～11.0 條件下酶活性較低，與前者具有顯著差異。氮源對(duì)ZJPL1812 發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的結(jié)果表明，以硝酸銨為氮源時(shí)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性最高（0.230 U/mL），其次是磷酸二氫銨，在蛋白胨、硝酸鈉、精氨酸、硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中酶活性均較低，其中以硫酸銨效果最差（圖8C），與無氮源培養(yǎng)基無顯著差異。菌株ZJPL1812 在不同碳源培養(yǎng)基上的幾丁質(zhì)酶活性不同（圖8D），在以可溶性淀粉、葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上酶活性最高，且均顯著高于其他碳源處理，在麥芽糖、山梨醇、蔗糖上酶活性較低，三者之間無顯著差異。

圖8 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株ZJPL1812 幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.8 Effects of different culture conditions on the chitinase activity of strain ZJPL1812

3 討論

柑橘粉虱座殼孢子座是由柑橘粉虱座殼孢菌（Aschersoni a aleyrodis）侵染柑橘粉虱各齡幼蟲之后形成的。本研究從該子座中除分離到柑橘粉虱座殼孢菌外，還成功分離到菌株ZJPL1812，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定確認(rèn)為淡紫紫孢菌，表明在雷州半島除粉虱座殼孢菌外，淡紫紫孢菌也可能對(duì)柑橘粉虱的種群控制有著重要貢獻(xiàn)。有研究表明，淡紫紫孢菌孢子可以侵染柑橘木虱成蟲［21］，此外，該菌還廣泛應(yīng)用于防治棉花蚜蟲（Aphis gossypiiGlover）［22］、蘿卜蚜（Lipalus erysimi）［23］、切葉蟻（Acromyrmex）［24］和甘薯粉虱（Bemisia tabaci）［25］等。因此，研究淡紫紫孢菌的適宜生長(zhǎng)環(huán)境和營養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)菌株最優(yōu)培養(yǎng)，并大量生產(chǎn)淡紫紫孢菌，對(duì)該菌后續(xù)作為生物防治劑的應(yīng)用具有重要意義。

本研究通過對(duì)菌株ZJPL1812 生物學(xué)特性的初步研究發(fā)現(xiàn)，該菌在15～35℃條件下均可生長(zhǎng)，其中30℃最適合，這與Girardi 等［26］、鄧嘉茹等［27］研究結(jié)果基本一致。同時(shí)，發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶（蛋白酶、幾丁質(zhì)酶）影響結(jié)果表明，該菌具有較廣的產(chǎn)酶溫度范圍（10～35℃），以30℃為最適溫度。已報(bào)道的淡紫紫孢菌最適產(chǎn)幾丁質(zhì)酶溫度也多在30℃左右［28-29］，少數(shù)菌株需要更高的發(fā)酵溫度（60℃）［30］。綜合前人及本研究結(jié)果可知，該菌所需的生長(zhǎng)、產(chǎn)酶溫度范圍較廣，但最佳生長(zhǎng)溫度、產(chǎn)酶溫度較窄，因此在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)確定適當(dāng)施用時(shí)機(jī)，不宜在長(zhǎng)時(shí)間較高溫或較低溫的季節(jié)施用，以保證菌株活性及防治效果。

本研究顯示菌株ZJPL1812 在pH 5.0～9.0 條件下均可生長(zhǎng)，表明該菌能適應(yīng)弱酸性或弱堿性的生長(zhǎng)環(huán)境。而根結(jié)線蟲適宜的土壤pH 值為4.0～8.0、生長(zhǎng)發(fā)育溫度為20～28℃，與該菌適宜生長(zhǎng)環(huán)境條件相吻合。這有利于該菌的田間應(yīng)用，可在一定程度上緩解根結(jié)線蟲病害。

微生物所產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶根據(jù)所適應(yīng)的pH 值不同可以分為酸性、中性和堿性，而真菌產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶多為酸性蛋白，其蛋白酶反應(yīng)的最適pH 范圍為3.8～5.6，幾丁質(zhì)酶最適pH 范圍為4.0～7.0［31-32］。本試驗(yàn)中ZJPL1812 發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶均在pH 值為5.0～9.0 內(nèi)保持穩(wěn)定，且在pH 值5.0 時(shí)保持較高活性，屬于酸性蛋白酶和酸性幾丁質(zhì)酶，表明該菌所產(chǎn)酶的pH 值穩(wěn)定范圍較寬、酸堿耐受性很強(qiáng)，適于工業(yè)生產(chǎn)。

此外，有研究表明淡紫擬青霉（即淡紫紫孢菌）能利用多種碳源（單糖、寡糖、多糖）和多種氮源（有機(jī)、無機(jī)、硝態(tài)氮和氨態(tài)氮），簡(jiǎn)單無機(jī)物質(zhì)（迅速利用型，如氨態(tài)氮）易于被菌體吸收利用［33］。本試驗(yàn)在研究培養(yǎng)基碳源、氮源對(duì)淡紫紫孢菌生長(zhǎng)的影響等方面與已報(bào)道的淡紫擬青霉有相似之處，該菌在無機(jī)氮源上產(chǎn)生的菌絲干質(zhì)量顯著高于有機(jī)氮培養(yǎng)基，但在碳源中對(duì)麥芽糖的利用率最佳，這與肖順“選用結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的可溶性淀粉為最適碳源，最利于菌株的液體培養(yǎng)”［34］的研究結(jié)果不同。這可能是由于淡紫紫孢菌為土壤寄生真菌，其生物學(xué)特性與土壤環(huán)境中的多種因素有關(guān)，不同地區(qū)、不同物種所分離得到的菌株生物學(xué)特性存在差異。

除溫度、pH 值條件外，營養(yǎng)成分條件也是影響淡紫紫孢菌發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素之一。不同菌株對(duì)氮源的利用和產(chǎn)蛋白酶情況相同，本試驗(yàn)結(jié)果表明蛋白胨是提高產(chǎn)蛋白酶的有效氮源，這與趙培靜等“蛋白胨對(duì)于淡紫擬青霉的蛋白酶高產(chǎn)有促進(jìn)效果”［35］的結(jié)論相同，表明高分子有機(jī)氮對(duì)蛋白酶具有誘導(dǎo)作用。但不同菌株對(duì)氮源的利用和產(chǎn)幾丁質(zhì)酶情況并不相同，張馨月等［29］采用固體發(fā)酵淡紫紫孢菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶以蛋白胨作氮源時(shí)活性達(dá)到最高，而本研究所產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶以硝酸銨為最佳氮源、以蛋白胨為氮源時(shí)活性較低，表明無機(jī)氮比有機(jī)氮誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果更佳。已有報(bào)道表明，在淡紫擬青霉產(chǎn)幾丁質(zhì)酶時(shí)以殼聚糖作為誘導(dǎo)底物并添加葡萄糖，可使幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量維持在較穩(wěn)定水平，但整體產(chǎn)酶量不高，可能是產(chǎn)生了葡萄糖效應(yīng)。本研究中以葡萄糖為碳源時(shí)的淡紫紫孢菌產(chǎn)酶能力在所供試碳源中最佳。

以上研究結(jié)果表明，菌株ZJPL1812 具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和較廣泛的酸堿適應(yīng)能力，同時(shí)還可以利用多種氮源和碳源。但自然篩選菌株所產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶的能力較低，為進(jìn)一步提高酶活性、促進(jìn)淡紫紫孢菌作為生物防治劑商業(yè)化發(fā)展，還需要通過復(fù)合誘變技術(shù)篩選高產(chǎn)菌株，或者通過基因重組技術(shù)進(jìn)行蛋白酶、幾丁質(zhì)酶基因的序列分析、克隆表達(dá)和生產(chǎn)。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)紅江橙葉片粉虱座殼孢上的菌株進(jìn)行分離純化及鑒定，確定菌株ZJPL1812 為淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）。對(duì)其生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，該菌最佳培養(yǎng)溫度為30℃、適宜pH 值為5.0～9.0；可利用多種不同碳源、氮源，以磷酸二氫銨為氮源、麥芽糖為碳源時(shí)最有利于菌絲生長(zhǎng)，以蛋白胨為氮源、蔗糖為碳源時(shí)產(chǎn)蛋白酶活性最高，以硝酸銨為氮源、可溶性淀粉為碳源時(shí)幾丁質(zhì)酶活性最高。該菌株所產(chǎn)蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活性較高，具有一定的生物防治潛力。