劉 泉，劉 軍，王 緣，楊彩春，陳順友，李長(zhǎng)春*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2.湖北梅之苑生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，湖北黃岡 438000）

梅花星豬（圖1）屬中國(guó)優(yōu)良地方品種，源于中國(guó)華中地區(qū)黃梅縣一帶，部分豬在額、鼻、下腹、尾間和四肢下端有白毛，其中額部白毛呈現(xiàn)梅花狀，故被稱為梅花星豬，具有易飼喂、繁殖力高、抗逆性好和肉質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)。該豬屬中等體格類型，對(duì)高溫高濕、低溫高濕等氣候條件有較強(qiáng)的耐受能力，適于在農(nóng)院與平原湖區(qū)養(yǎng)殖。

圖1 梅花星豬

增食欲素（Orexin）是1998 年由Sakurai 等與De Lecea在小鼠下丘腦神經(jīng)元中同時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種重要肽類物質(zhì)，Orexin 的前體肽是增食欲素前體（Preproorexin），Orexin 包含2 個(gè)單體即Orexin A 與Orexin B，位于第12 號(hào)染色體上，由2 個(gè)外顯子與1 個(gè)內(nèi)含子組成。而下丘腦是控制采食和能量穩(wěn)態(tài)的重要區(qū)域，Orexin 是由專門(mén)位于下丘腦外側(cè)神經(jīng)元分泌的興奮性神經(jīng)肽，其神經(jīng)纖維分布在大腦的各個(gè)區(qū)域，說(shuō)明其可能與食欲調(diào)節(jié)存在相關(guān)性。進(jìn)一步研究表明，Orexin 的分泌影響食欲變化并參與許多生理功能，如調(diào)節(jié)攝食、睡眠喚醒、記憶認(rèn)知、刺激胃酸分泌和新陳代謝等。

基因在不同物種中具有較高的同源性，且均與動(dòng)物個(gè)體采食量相關(guān)。White 等通過(guò)小鼠注射試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)其采食量與A 的注射量顯著正相關(guān)。同時(shí)Eliassi 等研究發(fā)現(xiàn)增加表達(dá)量能刺激胃酸的分泌，提高個(gè)體食欲。另外，Malek 等研究發(fā)現(xiàn)豬的采食量與Orexin 前體肽基因的多態(tài)性有關(guān)。上述研究均表明基因?qū)?dòng)物采食量具有重要的影響。

目前，基因與豬個(gè)體的采食、豬飼料轉(zhuǎn)化效率和生長(zhǎng)相關(guān)的研究較少。本實(shí)驗(yàn)將豬基因作為候選基因，檢測(cè)了基因第G516A 位點(diǎn)的多態(tài)性，并對(duì)基因不同基因型與日采食量、平均日增重等生長(zhǎng)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析，旨在探究基因?qū)ωi飼料轉(zhuǎn)換效率相關(guān)性狀影響，以期為豬分子標(biāo)記輔助選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自湖北梅之苑生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司梅花星保種場(chǎng)。采集相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下59 頭梅花星豬的耳組織樣品，其中安系、梅系和蘄系分別為12、12、35 頭。實(shí)驗(yàn)豬體重的測(cè)定從體重15 kg時(shí)開(kāi)始，至80 kg 時(shí)結(jié)束，體重稱取方法為晨飼前空腹稱重；實(shí)驗(yàn)豬采用單欄飼喂自由采食，每日記錄耗料，同時(shí)計(jì)算出當(dāng)日實(shí)際采食量（當(dāng)日實(shí)際采食量=當(dāng)日總投料量-剩余量）。

1.2 主要試劑及儀器 主要試劑：全基因組DNA 提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；I 限制性內(nèi)切酶、PCR 聚合酶、瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)thermofisher 公 司；TAE、DNA Maker、Gel Red 購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司等。

主要儀器：梯度PCR 儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司；Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad；凝膠電泳儀購(gòu)自北京六一儀器。

1.3 基因組DNA 提取 使用全基因組DNA 提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit 從所采耳組織樣本中提取基因組DNA，具體操作步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取DNA 后使用分光光度計(jì)檢測(cè)濃度，并置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)合成 以GenBank 上的豬基因序列（NC_010454.3）作為模板序列，利用Oligo7.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.5 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系為10 μL：DNA 模板1 μL（551 ng/μL），正反向引物各0.2 μL（10 μmol/L），PCR mix 5 μL（5 U/μL），加入無(wú)菌超純水補(bǔ)至總體積10 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，循環(huán)30 次；最后72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用2℃（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至上海英駿公司測(cè)序。

1.6 RFLP 酶切分型 本實(shí)驗(yàn)選取的限制性內(nèi)切酶為I酶。PCR 產(chǎn)物酶切體系為10 μL：5 μL PCR 產(chǎn)物，3.5 μL無(wú)菌超純水，1 μL（10×）buffer，0.5 μL（10 U/μL）限制性內(nèi)切酶。37℃培養(yǎng)箱放置過(guò)夜，酶切產(chǎn)物用3.5%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分型。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 利用Excel 計(jì)算基因頻率、基因型頻率、卡方檢驗(yàn)結(jié)果及多態(tài)信息含量等遺傳變異參數(shù)，使用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)基因多態(tài)性和生長(zhǎng)性狀進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1基因PCR-RFLP 結(jié)果 對(duì)59 頭梅花星豬耳組織DNA 樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，圖2 結(jié)果表明，獲得長(zhǎng)度為215 bp 的基因片段，條帶清晰明亮，與預(yù)期片段大小相符。并用I 限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切分型，圖3 結(jié)果顯示，在該位點(diǎn)存在3 種基因型，分別是含有215、179、36 bp 3 條帶的GA 基因型、含有179 bp 和36 bp 2 條帶的AA 基因型和只有1 條215 bp條帶的GG 基因型。

圖2 豬Orexin 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖3 豬Orexin 基因酶切結(jié)果

2.2 豬基因遺傳特性分析

2.2.1 基因型頻率與基因頻率 由表2 可知安系、梅系和蘄系梅花星豬基因第G516A 位點(diǎn)的基因頻率與基因型頻率。安系GA 基因型為優(yōu)勢(shì)基因型（0.583 3），等位基因A 為安系的優(yōu)勢(shì)等位基因；梅系和蘄系中GG 基因型頻率最高（分別為0.583 3、0.485 8），AA 基因型頻率最低（分別為0、0.057 1），等位基因G 為梅系和蘄系的優(yōu)勢(shì)基因。卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明，3 個(gè)品系基因均處在Hardy-Weinberg 平衡。

表2 Orexin 基因的基因型頻率和基因頻率

2.2.2 遺傳多態(tài)性分析 由表3 可知梅花星豬基因I 酶切位點(diǎn)遺傳多態(tài)性遺傳變異參數(shù)。安系、梅系和蘄系的多態(tài)信息含量分別為0.358 9、0.324 9、0.275 4，均處于中度多態(tài)（0.25

表3 Orexin 基因的遺傳變異參數(shù)

2.3基因多態(tài)性與豬生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析 使用SPSS 24.0 軟件對(duì)基因第G516A 位點(diǎn)多態(tài)性與安系、梅系和蘄系的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。蘄系基因不同基因型與采食量和平均日增重均存在顯著相關(guān)性，其中GG、GA 基因型平均日增重極顯著高于AA 基因型，GG、GA 基因型采食量顯著高于AA 基因型。安系GG、GA 基因型在采食量和平均日增重上均大于AA 基因型，梅系GG 基因型在采食量和平均日增重上均大于GA 基因型。

表4 Orexin 基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表5 可知，基因與采食量和平均日增重均存在極顯著關(guān)聯(lián)性，GG、GA 基因型在采食量和平均日增重上極顯著高于AA 基因型，在飼料轉(zhuǎn)化效率上無(wú)顯著差異。

表5 Orexin 基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

目前，關(guān)于基因多態(tài)性與梅花星豬生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析未有報(bào)道。胡偉等通過(guò)對(duì)前體肽基因第C62T 位點(diǎn)和第G426A 位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這2 個(gè)位點(diǎn)與長(zhǎng)白豬的平均日增重和每次采食量有顯著關(guān)聯(lián)（<0.05）。張愛(ài)玲研究發(fā)現(xiàn)南陽(yáng)?；虻贑468T 位點(diǎn)不同基因型顯著影響平均日增重和月齡體重（<0.05）。成宏研究了美系純種大白豬基因第G516A 位點(diǎn)不同基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)，結(jié)果表明基因與日采食量、平均日增重有極顯著差異（<0.01），與剩余采食量、預(yù)測(cè)采食量有顯著差異（<0.05），GG、GA 基因型大白豬個(gè)體在日采食量和平均日增重上極顯著大于AA 型個(gè)體。

本研究在梅花星豬基因第G516A 位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變，且其變異會(huì)影響梅花星豬的采食量和平均日增重。通過(guò)PCR-I-RFLP 方法發(fā)現(xiàn)梅花星豬基因第G516A 位點(diǎn)存在GG、GA 和AA 3 種基因型。遺傳變異參數(shù)結(jié)果顯示，安系雜合度高于梅系和蘄系，表明該位點(diǎn)在安系群體中具有較高的遺傳變異程度；基因在安系、梅系、蘄系中的多態(tài)信息含量均符合中度多態(tài)，說(shuō)明該基因在群體中的遺傳基礎(chǔ)較高且存在較高的選擇潛力。根據(jù)基因型與基因頻率結(jié)果，梅系和蘄系優(yōu)勢(shì)基因型為GG 基因型，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镚；安系優(yōu)勢(shì)基因型為GA 基因型，A 為優(yōu)勢(shì)等位基因。盡管在不同品系基因型頻率分布存在差異，但在梅花星豬中G等位基因頻率明顯高于A 等位基因頻率，可能是梅花星豬在養(yǎng)殖過(guò)程中已被進(jìn)行了人工選育，含有AA 基因型的個(gè)體不能滿足生產(chǎn)需要而被篩選淘汰。

關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，當(dāng)把蘄系、梅系和安系作為一個(gè)群體時(shí)，基因的第G516A 位點(diǎn)對(duì)梅花星豬日采食量與平均日增重存在極顯著影響。GG 與GA 基因型個(gè)體的采食量極顯著高于AA 基因型個(gè)體，表明G基因?qū)€(gè)體的采食量有顯著的提高作用；GG 與GA 基因型個(gè)體的平均日增重極顯著高于AA 基因型個(gè)體，表明G 基因?qū)€(gè)體的平均日增重有顯著的提高作用。這與成宏在美系純種大白豬上的研究結(jié)果一致，增加了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。結(jié)合成宏研究結(jié)果，說(shuō)明基因可作為梅花星豬采食量和平均日增重的一個(gè)關(guān)鍵候選基因，通過(guò)選擇和保留更多的GG 和GA 基因型梅花星豬，以提高實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效率。安系、梅系關(guān)聯(lián)分析與合并關(guān)聯(lián)分析結(jié)果存在差異，可能的原因在于對(duì)各個(gè)品系采集的樣本含量過(guò)少，基因型在品系中分布不均。下一步可增大各個(gè)品系樣本含量，以檢測(cè)基因在不同品系的多態(tài)性，進(jìn)一步確認(rèn)該位點(diǎn)與不同品系梅花星豬采食量和平均日增重的關(guān)聯(lián)性，為個(gè)體選育提供更加準(zhǔn)確的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，梅花星豬基因的第G516A 位點(diǎn)G 等位基因頻率最高；基因?qū)γ坊ㄐ秦i的采食量和平均日增重有極顯著影響，表現(xiàn)為該位點(diǎn)的GG和GA 基因型個(gè)體可顯著提高平均日增重和采食量，說(shuō)明第G516A 位點(diǎn)與梅花星豬生長(zhǎng)性狀存在關(guān)聯(lián)性，可將其作為一個(gè)選育梅花星豬的可靠分子標(biāo)記。在生產(chǎn)實(shí)踐中，可以通過(guò)選擇GG 和GA 型個(gè)體來(lái)縮短出欄日齡，從而提高經(jīng)濟(jì)效率。