林 輝，劉艷玲，羅海凌，王 彤,2，林占熺，蘇德偉，林興生，林冬梅 *

（1.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350010；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350010）

0 引言

【研究意義】蘆竹（Arundo donaxL.）屬被子植物門的禾本科蘆竹屬，是一種多年生的草本植物，其植株高大，產(chǎn)量高，生長3年的蘆竹生物量可達35 kg·m?2。蘆竹綜合利用價值高，可生產(chǎn)食用菌、板材、紙張，作為生物質(zhì)能源發(fā)電、生產(chǎn)沼氣，還可用于生態(tài)治理等。蘆竹對土壤酶活及土壤微生物群落的影響的研究，可為蘆竹的推廣種植提供理論基礎(chǔ)，促進蘆竹的開發(fā)利用，為實現(xiàn)雙碳目標(biāo)貢獻力量?！厩叭搜芯窟M展】土壤微生物作為陸地生態(tài)系統(tǒng)中的重要角色，參與土壤中有機質(zhì)分解與轉(zhuǎn)換、養(yǎng)分的循環(huán)與利用和土壤結(jié)構(gòu)與形成等諸多主要生態(tài)學(xué)過程，能夠促進土壤物質(zhì)循環(huán)、穩(wěn)定與保持土壤的生產(chǎn)力和健康，且作物的生長與病害、土壤環(huán)境及溫室氣體的排放等都與土壤微生物密切相關(guān)[1?5]，而土壤微生物的多樣性和分布與土壤肥力及其所處的環(huán)境亦密切相關(guān)[6]。Zimmerman等研究表明，土壤細(xì)菌、真菌和放線菌可決定土壤微生物總量的分布以及有機物的分解與轉(zhuǎn)化[7]；此外，土壤微生物還是土壤酶的主要來源，土壤酶幾乎參與土壤中所有的生物化學(xué)反應(yīng)，酶活性表征著土壤中物質(zhì)代謝的旺盛程度，是土壤肥力的一個重要指標(biāo)，同時土壤酶影響著土壤微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)[8?9]。菌草是指所含營養(yǎng)適合食用菌、藥用菌等微生物生長需要，并具有綜合開發(fā)利用價值的草本植物[10?13]，主要包括禾本科、里白科等共計20多個屬46個種的植物[14?15]，蘆竹屬菌草品種是菌草的重要組成部分。20世紀(jì)80年代，為了替代林木作為培養(yǎng)基栽培食（藥）用菌，菌草概念應(yīng)運而生，隨之菌草栽培食藥用菌、菌草生態(tài)治理、菌草菌物飼料等應(yīng)用方面的研究相繼開展[16]，實現(xiàn)了在促進食用菌產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的同時，經(jīng)濟、生態(tài)與社會三者效益的有機統(tǒng)一[12]。菌草的太陽能轉(zhuǎn)化率為闊葉樹的4～6倍，根量為一般農(nóng)作物的3～5倍，維系土壤肥力比農(nóng)作物高15倍。因此，它對土壤的防沖能力和吸附雨水能力要強于森林和農(nóng)作物，故被稱作為環(huán)境保護和修復(fù)的最好植物之一[17]?！颈狙芯壳腥朦c】對于蘆竹屬菌草，在其綜合利用方面有較多的研究，但在生態(tài)治理方面，有研究表明在荒漠化土壤種植Lz1可顯著提高沙質(zhì)土壤有機質(zhì)含量，土壤中活性酶及微生物總量也顯著增多[18]，而對其他蘆竹品種以及在黏質(zhì)土的微生物種群情況，則有待深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對種植蘆竹屬6種不同菌草后的土壤開展研究，解析種植前后土壤酶活和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。采用Illumina-MiSeq高通量測序技術(shù)，對種植蘆竹屬6種不同菌草和未種植任何植物的土壤微生物進行測序，發(fā)現(xiàn)和挖掘蘆竹屬不同菌草的種植對土壤微生物群落多樣性的影響，以及土壤微生物多樣性與土壤養(yǎng)分、土壤酶活之間的關(guān)系，為做好菌草種植、推廣以及菌草生態(tài)治理等提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

位于福州市閩侯縣福建農(nóng)林大學(xué)旗山校區(qū)內(nèi)，國家菌草工程技術(shù)研究中心菌草種質(zhì)資源圃（N26.05°，E119.18°），該地區(qū)屬于亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，氣溫適宜，溫暖濕潤，四季常青，陽光充足，雨量充沛，霜少無雪，夏長冬短，無霜期達326 d，年平均日照數(shù)為 1 700～1 980 h；年平均降水量為 900～2 100 mm；年平均氣溫為 20～25 ℃，年相對濕度約77%。

1.2 試驗方法

采樣點為種植5年后的蘆竹屬（ArundoL.）6個菌草品種，由福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技研究中心菌草種質(zhì)資源圃提供，其中綠洲1號Lz1（H）、綠洲2號Lz2（I）、綠洲3號Lz3（J）、綠洲5號Lz5（K）、綠洲6號Lz6（L）和綠洲9號Lz9（M）分別來自萊索托、山東、福建、厄立特里亞、西藏和陜西，空白對照（CK）為中心菌草種質(zhì)資源圃周圍未種植任何植物的區(qū)域。每種菌草種植區(qū)30 m2，種植區(qū)內(nèi)隨機選取3處，根據(jù)5點取樣法在每個采樣點取樣，去除表層殘葉和浮土，取根系周圍5 ～30 cm深度的土壤，每處采集的5點土樣混勻為1個樣品，每個試驗區(qū)分別采集3個樣品。采集樣品后，去除植物根、動物殘骸及其他雜質(zhì)，混勻過2 mm篩，一部分保存在10 mL無菌離心管中，用干冰保存送往北京奧維森基因科技有限公司，對采集的土壤樣品進行微生物多樣性檢測；另一部分將采集的土壤放入密封袋中，常溫避光條件下風(fēng)干、磨細(xì)和過篩，進行土壤樣品分析，均隨機采集3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3 土壤養(yǎng)分和酶活性測定

土壤pH值采用pH計測定，土壤有機碳、速效磷、速效氮和全氮等養(yǎng)分采用《土壤農(nóng)化分析》[19]的方法進行測定；土壤酶活性采用蘇州科銘生物科技有限公司購買的試劑盒測定。

1.4 土壤微生物多樣性測定分析方法

取土壤樣品 0.5 g，根據(jù) E.Z.N.A.Soil DNAKit試劑盒說明書操作流程提取土壤總DNA，然后對提取的土壤總DNA分別進行細(xì)菌16SrDNA和真菌ITS擴增。將真菌和細(xì)菌的擴增子構(gòu)建Miseq文庫，Illumina Miseq上機測序，利用Trimmomatic、Pear對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、過濾、拼接得到有效數(shù)據(jù)，然后對測序結(jié)果進行個性化分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 23.0 和 GraphPad Prism 8.3 軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用SPSS單因素（one-way ANOVA）法進行方差分析和差異顯著性比較，用Pearson法進行相關(guān)性分析。采用GraphPad Prism 8.3軟件作圖。圖表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 種植不同菌草對土壤養(yǎng)分及土壤酶活的影響

2.1.1 土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分 從表1看出，蘆竹屬不同菌草種植區(qū)域的土壤均偏酸性，其中Lz3的土壤pH值最低，為5.43；Lz6土壤pH值6.21，且與對照組、Lz1、Lz2、Lz3和Lz9之間存在顯著差異（P＜0.05）。種植菌草的土壤中速效磷（AP）含量均高于對照組未種植菌草的AP含量，其中Lz9和Lz1土壤速效磷含量最高，均大于 8.00 mg·kg?1，差異顯著（P＜0.05）。土壤中的速效氮（AN）和全氮（TN）含量基本一致，均是Lz1含量最高，且顯著高于未種植菌草的土壤速效氮和全氮含量（P＜0.05）。土壤中有機碳（SOC）含量亦是Lz1最高，Lz9和Lz3次之，與未種植菌草對照組土壤有機碳含量有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 種植蘆竹屬不同菌草對土壤主要養(yǎng)分的影響Table 1 Nutrients in soil as affected by planting of different arundo grasses

2.1.2 土壤酶活 不同土壤樣品的酶活性如圖1所示，種植菌草的土壤脲酶（URE）活性均極顯著高于對照組（P＜0.01），其中Lz9脲酶活性最高（859.40 μg·g?1·d?1），Lz1 次 之（ 793.40 μg·g?1·d?1）。Lz5土壤中過氧化氫酶（CAT）活性最高（47.19 μmol·g?1·d?1），Lz6 次之（43.26 μmol·g?1·d?1），均極顯著高于未種植菌草的土壤酶活（P＜0.01）。Lz5土壤中的蔗糖酶（INV）活性最高（15.91 mg·g?1·d?1），且極顯著高于未種植菌草的土壤蔗糖酶酶活（P＜0.01），Lz1的土壤酸性磷酸酶（ACP）活性極顯著高于未種植菌草的ACP活性（P＜0.01）。

圖1 種植蘆竹屬不同菌草對土壤酶活的影響Fig.1 Enzyme activity in soil as affected by planting of different arundo grasses

2.1.3 土壤特性與土壤酶活相關(guān)性分析 由表2 Pearson相關(guān)性結(jié)果分析可知，土壤過氧化氫酶與土壤pH值有顯著的正相關(guān)性（P＜0.05）。土壤脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶與pH值均無顯著相關(guān)性。土壤脲酶與速效磷、速效氮、有機碳和全氮均有極顯著的正相關(guān)性（P＜0.01）；相反，過氧化氫酶與速效磷、速效氮、有機碳和全氮均有極顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.01）。而土壤蔗糖酶與速效磷、速效氮、有機碳和全氮相關(guān)性不顯著（P＞0.05），土壤酸性磷酸酶與速效氮、全氮均有顯著的正相關(guān)性（P＜0.05），與有機碳有極顯著正相關(guān)性（P＜0.01）。

表2 土壤特性與土壤酶活的Pearson相關(guān)性Table 2 Pearson correlation between characteristics and enzyme activity of soil

2.2 不同菌草種植對土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 土壤微生物多樣性 土壤微生物多樣性的評估指數(shù)結(jié)果分析見表3，其中Chao指數(shù)代表群落豐富度，數(shù)值越大表明物種豐度越高；Shannon指數(shù)代表群落多樣性，數(shù)值越大表明其群落多樣性越高。由分析結(jié)果可知，種植幾種菌草的土壤細(xì)菌Ace、Chao指數(shù)均顯著高于對照組未種植菌草（P＜0.05），Lz1、Lz2和Lz5細(xì)菌Shannon指數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），而Coverage指數(shù)和Simpson指數(shù)與對照組差異均不顯著（P＞0.05）。Lz1、Lz2和Lz3的土壤真菌Ace、Chao指數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），種植幾種菌草的土壤真菌Shannon指數(shù)均顯著高于對照組（P＜0.05），而土壤Simpson指數(shù)只有Lz6顯著低于對照組（P＜0.05），Coverage指數(shù)與對照組差異均不顯著（P＞0.05）。分析結(jié)果表明7個樣品的細(xì)菌文庫覆蓋率均達到96%、真菌文庫覆蓋率達99%，表明大部分微生物種群均能被檢測出，可代表樣本的真實情況。

表3 不同土壤樣品微生物豐度和多樣性Table 3 Microbial abundance and diversity of soil samples

2.2.2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu) 由圖2可知，種植菌草的土壤樣品中變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度均高于對照組，Lz9最高，與對照組相比，提高了47.15%，Lz5和Lz1次之，與對照組相比較分別提高了21.1%、20.7%；酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度大小順序為：Lz6＞Lz5＞Lz3＞Lz1＞Lz9＞對照組＞Lz2，Lz6比對照組提高了17.3%；綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度則是對照組最高；放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度大小順序為：Lz2＞Lz1＞Lz3＞Lz9＞Lz6＞對照組＞Lz5，其中與對照組相比，Lz2和Lz1分別提高了86.3%、68.6%。

圖2 門水平細(xì)菌最大豐度排名前20的物種相對豐度Fig.2 Relative abundance of top 20 bacteria at phylum level

不同土壤樣品門水平真菌最大豐度排名如圖3所示，其中子囊菌門（Ascomycota）相對豐度大小順序為：Lz9＞Lz1＞＞Lz3＞Lz5＞Lz2＞對照組＞Lz6，Lz9和Lz1分別比對照組豐度提高了53.2%、32.9%；種植6種菌草的土壤樣品中，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）相對豐度均高于對照組，其中Lz6的相對豐度最高；Lz1、Lz2和Lz3次之；種植六種菌草的被孢菌門（Mortierellomycota）的相對豐度均低于對照組。

圖3 門水平真菌最大豐度排名前16的物種相對豐度Fig.3 Relative abundance of top 16 fungi at phylum level

2.3 土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)與土壤酶活相關(guān)性分析

2.3.1 土壤微生物多樣性指數(shù)與土壤酶活相關(guān)性分析 土壤微生物多樣性由Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)等來反映，由表4結(jié)果可知，蔗糖酶與細(xì)菌Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），酸性磷酸酶與Shannon指數(shù)呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），與細(xì)菌Ace指數(shù)、Chao指數(shù)存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系；而酸性磷酸酶與真菌的Ace指數(shù)存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

表4 微生物多樣性指數(shù)與土壤酶活的相關(guān)關(guān)系Table 4 Correlation between microbial diversity index and enzyme activity of soil

2.3.2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤酶活相關(guān)性分析 土壤微生物優(yōu)勢門類與4種土壤酶活之間的相關(guān)關(guān)系如表5 所示，變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、梭桿菌門（Saccharibacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）等4個細(xì)菌菌門的相對豐度與URE活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），而綠彎菌門（Chloroflexi）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）與URE活性呈現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），芽單胞菌門（Gemmatimonadetes ）與URE活性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；綠彎菌門（Chloroflexi）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）與CAT活性存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）與CAT活性存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；硝化螺旋菌門（Nitrospirae）與INV活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），芽單胞菌門（Gemmatimonadetes ）與INV活性呈現(xiàn)正相關(guān)（P＜0.05），疣微菌門（Verrucomicrobia）與INV活性呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；放線菌門（Actinobacteria）與ACP活性呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

表5 土壤微生物優(yōu)勢門類與土壤酶活之間的相關(guān)關(guān)系Table 5 Correlations among dominant microbial phyla,nutrients, and enzyme activity in soil

真菌的優(yōu)勢菌門中，子囊菌門（Ascomycota）與URE活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），被孢霉門（Mortierellomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、Kickxellomycota和Calcarisporiellomycota 與URE活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；被孢霉門（Mortierellomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、Kickxellomycota和Calcarisporiellomycota與CAT活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），子囊菌門（Ascomycota）與CAT活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。

3 討論與結(jié)論

土壤養(yǎng)分是衡量土壤肥力狀況的指標(biāo)之一，福建農(nóng)林大學(xué)旗山校區(qū)國家菌草工程技術(shù)研究中心菌草種質(zhì)資源圃建在用黏土及石塊填方的土地，土壤肥力差。蘆竹屬菌草抗性強，耐貧瘠，種植5年來，在該土地上不僅正常生長，而且長勢旺盛。本研究選用的是種質(zhì)資源圃種植蘆竹屬菌草5年后的土壤與未種植區(qū)域土壤進行比較，結(jié)果表明：所測區(qū)域土壤均屬于酸性土壤（5.4～6.2），其中Lz6所種植區(qū)域土壤pH值最高，Lz3土壤pH值最低；Lz1、Lz9、Lz3的土壤有機碳、AN、TN含量等均顯著高于未種植土壤的各養(yǎng)分含量。由結(jié)果可知，種植5年的蘆竹屬菌草，可增加土壤養(yǎng)分的含量，提高土壤肥力，但由于蘆竹屬不同菌草品種的生長特性存在一定差異，因此不同菌草種植區(qū)的土壤養(yǎng)分亦存在一定的差異。

土壤酶活性是微生物功能的表現(xiàn)，參與了土壤中許多重要的生物化學(xué)過程，與土壤養(yǎng)分有著密切的關(guān)系[20]，土壤pH值、土壤有機質(zhì)、AP、AN、TN含量等土壤理化性質(zhì)都會對土壤酶活產(chǎn)生顯著的影響。土壤酶活性結(jié)果顯示，種植蘆竹屬6種菌草的土壤脲酶活性均極顯著高于未種植菌草的對照組，其中Lz1和Lz9的脲酶活性最高，這與Lz1和Lz9土壤有機質(zhì)含量高的結(jié)果一致，且Pearson相關(guān)分析亦表明脲酶活性與土壤有機質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.01）。諸多研究結(jié)果亦表明，土壤中有機質(zhì)含量高，土壤脲酶活性也會相應(yīng)提高[21?23]。土壤過氧化氫酶活性與土壤呼吸強度和土壤微生物活動相關(guān)，是重要的土壤微生態(tài)環(huán)境指示因子[24?25]，能有效防止過氧化氫的毒害，而過氧化氫酶和蔗糖酶活性則是種植Lz5的土壤酶活性最高，均顯著高于對照組，酸性磷酸酶活性則是種植Lz1的土壤最高，顯著高于對照組。影響土壤酶活性的因子較多，在不同的研究中所得結(jié)論也不盡相同[26]。本研究相關(guān)性結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，供試4種土壤酶中，脲酶活性與土壤速效磷、速效氮、有機碳和全氮呈極顯著的相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），蔗糖酶與幾種土壤養(yǎng)分無顯著的相關(guān)性，亦說明土壤酶活性受多因子協(xié)同作用影響。

土壤微生物群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)，受土壤理化性質(zhì)、不同土壤條件和環(huán)境的差異影響，在不同土壤條件和環(huán)境中，土壤微生物群落存在很大差別[27]?；诟咄繙y序的分析結(jié)果表明，蘆竹屬不同菌草土壤微生物的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)存在一定差異，種植菌草土壤微生物中細(xì)菌和真菌的Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)均高于對照組，亦說明了種植菌草以后土壤微生物的多樣性和豐度總體高于未種植。而不同種植區(qū)域微生物優(yōu)勢菌門大致相似，其中Lz1土壤微生物中變形菌門、酸桿菌門、放線菌門等相對豐度均大于對照組。

土壤中有機碳是土壤微生物群落的能量和微生物細(xì)胞組成成分的主要來源，還是土壤微生物新陳代謝的主要產(chǎn)物[28]。由本研究土壤微生物優(yōu)勢門類與土壤酶活的相關(guān)性結(jié)果可知，變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、梭桿菌門（Saccharibacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）等細(xì)菌的相對豐度均與土壤中URE活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。同樣，研究結(jié)果表明優(yōu)勢菌門與土壤酶活性的相關(guān)性存在差異，相關(guān)性并不是呈現(xiàn)出一致的趨勢。植物-土壤-微生物之間的關(guān)系非常復(fù)雜，相互作用、相互影響[29?31]，但不同蘆竹種植的土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)存在一定差異，且與土壤養(yǎng)分和土壤酶活的具有一定的相關(guān)性。

綜上所述，種植蘆竹屬6種不同菌草后，土壤養(yǎng)分、土壤酶活、土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異，但與未種植蘆竹屬菌草的空白對照地相比，種植lz1、Lz9土壤中速效磷、速效氮、有機碳和總氮的含量以及土壤脲酶活性顯著升高。土壤微生物豐度和多樣性指數(shù)結(jié)果亦表明，種植蘆竹后，土壤微生物豐度和多樣性高于對照組。結(jié)合之前研究結(jié)果，種植蘆竹屬菌草Lz1有望在貧瘠的土壤條件下，起到改良土壤，提高土壤酶活性和土壤微生物多樣性的積極作用，為綠洲1號（Lz1）的推廣奠定理論基礎(chǔ)。