李敏敏，俞兆曦，張利平，劉 凱，肖 偉，劉彥斌，賽清云，田永華，吳旭東,3,4 *，連總強 *

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所，寧夏 銀川 750001；3.寧夏漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750001；4.寧夏漁業(yè)科技院士工作站，寧夏 銀川 750001）

0 引言

【研究意義】大多數(shù)脊椎動物為雌雄異體，其子代主要通過兩種方式?jīng)Q定性別：基因型性別決定（GSD）和環(huán)境性別決定（ESD）[1,2]。GSD通過具有性別差異的遺傳因素驅(qū)動，可以分為3個系統(tǒng)：雄性染色體異配的XY型、雌性染色體異配的ZW型和染色體性別決定的多生型[2]。ESD由溫度、缺氧、社會因素等環(huán)境因素影響觸發(fā)。性別二態(tài)性通常被稱為同一物種的雄性和雌性個體之間的差異，它與形態(tài)、解剖學(xué)、生理學(xué)、行為學(xué)和生活史等許多方面有關(guān)[3]。魚類是脊椎動物中最豐富的類群，表現(xiàn)出多樣化和多變的性別決定機制[3]，許多魚類已被證明在生長速度和體型等經(jīng)濟性狀上表現(xiàn)出顯著的性別二態(tài)性。例如，在鯉魚（Cyprinus carpio）[4]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[5]、南比目魚（Paralichthys lethostigma）[6]和半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[7]中，雌性比雄性長得更快且體型更大，而在黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[8]、 尼 羅 羅 非 魚（Oreochromis niloticus）[9]、 烏 蘇 里 擬 鲿（Pseudobagrus ussuriensis）[10]中，雄性比雌性長得更快且體型更大。因此，基于對性別決定與分化相關(guān)基因研究，在生長速度和體型性別二態(tài)性的魚類中生產(chǎn)全雌性或全雄性種群對水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要的經(jīng)濟意義?！厩叭搜芯窟M展】芳香化酶（P450arom）是性類固醇激素代謝中的一種重要酶類，屬于細(xì)胞色素P450家族，可催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，是雌激素生物合成的關(guān)鍵酶和限速酶[11]。在大多數(shù)哺乳動物中，P450arom由CYP19單基因編碼，但在魚類中卻發(fā)現(xiàn)了兩種不同基因編碼的P450arom，即性腺（卵巢）芳香化酶（cyp19a1a）和腦芳香化酶（cyp19a1b）。cyp19a1a作為雌激素合成的關(guān)鍵基因，廣泛參與調(diào)控雌雄異體魚類（如花鱸Lateolabrax maculatus[12]、鯽鯉[13]、泥鰍Misgurnus anguillicaudatus[14]等）以及雌雄同體魚類（如斑馬魚[15]、黃鱔Monopterus albus[16]、斜帶石斑魚Epinephelus coioides[17]、青鳉Oryzias latipes[18]等）的性別分化和性腺發(fā)育過程。研究表明，雌雄異體和雌雄同體雌性先熟魚類在卵巢分化過程中cyp19a1a表達水平顯著升高，并在卵巢發(fā)育過程中持續(xù)高表達，而雌雄同體雌性先熟魚類在性腺逆轉(zhuǎn)為精巢過程中cyp19a1a表達水平顯著降低，并在精巢發(fā)育期間一直保持低水平。cyp19a1a基因在魚類性腺的表達水平很容易受到外源環(huán)境影響，如溫度、性類固醇激素和芳香化酶抑制劑等。Ruksana等[19]對XX牙鲆進行芳香化酶抑制劑處理，使其卵巢逆轉(zhuǎn)為精巢，并導(dǎo)致cyp19a1a表達水平顯著降低。Vizziano等[20]研究表明通過外源雌激素（E2）處理可以將XY雄性虹鱒逆轉(zhuǎn)為XY偽雌魚，并導(dǎo)致cyp19a1a表達水平顯著升高。Zhang等[21]對cyp19a1a功能研究表明，敲除XX羅非魚cyp19a1a基因，使雌魚性逆轉(zhuǎn)為雄魚，通過持續(xù)的E2處理羅非魚cyp19a1a突變體的精巢表型成功逆轉(zhuǎn)為卵巢，而在停止E2處理后又恢復(fù)精巢，因為cyp19a1a的敲除導(dǎo)致羅非魚不能合成內(nèi)源性雌激素。蘭州鲇（Silurus lanzhouensis）又名黃河鯰，隸屬于鲇形目（Siluriformes）鲇科（Siluridea）鲇屬（Silurus），是我國黃河中上游特有土著經(jīng)濟魚類[22]，體型大、營養(yǎng)豐富，已成為我國重要的經(jīng)濟魚類，市場需求量穩(wěn)步增長[23]。與大多數(shù)鲇類相似，蘭州鲇需要3年才能性成熟，且成熟雄性個體較雌性個體大1.5倍，在生長速度和體型上具有明顯的性別二態(tài)性。有關(guān)蘭州鲇國內(nèi)已開展了種質(zhì)繁育[24,25]、良種選育[26,27]與飼料營養(yǎng)[28,29]等相關(guān)領(lǐng)域研究?！颈狙芯壳腥朦c】本項目組在蘭州鲇性別決定系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)[30]其為雄性異配XX/XY性別決定系統(tǒng)，對偶然發(fā)現(xiàn)的XY基因型雌雄同體親本進行自體精卵人工授精并成功獲得了YY雄性。此基礎(chǔ)上，需要進一步開展生長性狀具有性別二態(tài)性蘭州鲇cyp19a1a基因克隆及雌雄同體表達研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過同源克隆和RACE的方法獲得了蘭州鲇性腺型芳香化酶cyp19a1a基因的cDNA序列并進行生物信息學(xué)分析，采用qRT-PCR對cyp19a1a基因在蘭州鲇雌、雄魚和雌雄同體魚不同組織以及蘭州鲇雌、雄魚不同發(fā)育階段性腺表達情況進行比較分析，同時采用免疫組織化學(xué)方法對蘭州鲇不同發(fā)育階段性腺進行定位分析，以期為雌雄同體以及生長速度和體型性別二態(tài)性魚類性別決定與分化、性腺發(fā)育與維持調(diào)控機制研究提供基礎(chǔ)資料，為培育全雄蘭州鲇良種新品種提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所需蘭州鲇于2021年8月份取自寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所國家級蘭州鲇原種場建設(shè)基地。取3齡的蘭州鲇雌、雄魚和雌雄同體魚的腦、下丘腦、垂體、鰓、肌肉、胃、腸、心、肝、脾、腎、卵巢、精巢和3月齡、1齡蘭州鲇卵巢和精巢組織，雌雄各兩尾。取樣后迅速置于液氮中速凍后?80 ℃保存用于后續(xù)RNA提取。采集3月齡、1齡和3齡蘭州鲇雌、雄魚卵巢、精巢部分組織4%多聚甲醛固定，用于免疫組織化學(xué)檢測。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；DNA膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(shù)有限公司；2×TaqPlus Master Mix（Dye Plus）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、TB Green Premix ExTaqII、pMD18-T 克隆載體、SMARTer?RACE5′/3′Kit、DNAA-Tailing Kit試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；一抗購自Affinity，SP試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 總 RNA 提取和 cDNA 合成

參照總RNA提取試劑盒用戶手冊，提取蘭州鲇卵巢總RNA；使用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計（ALLSHFNG，中國）檢測RNA完整性和純度；參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒用戶手冊合成cDNA第一鏈，用于cyp19a1a中間序列克隆和熒光定量分析；參照 SMARTer ? RACE 5′/3′ Kit User Manual合成5′ - RACE Ready cDNA 和 3′ - RACE Ready cDNA，用于cyp19a1a5′/3′ 兩端序列克隆。

1.4 cyp19a1a 全長 cDNA 克隆

首先參考斑點叉尾鮰cyp19a1a基因序列（GenBank登錄號：NM_001329260.1），利用 Primer 6.0軟件設(shè)計引物cyp19a1a-F和cyp19a1a-R，用于擴增cyp19a1a基因中間序列。RT-PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，其 中 2×TaqPlus Master MixⅡ（Dye Plus）12.5 μL，cDNA 2 μL（經(jīng)稀釋 cDNA 的終濃度為 50 ng·μL?1），cyp19a1a-F（10 μmol·L?1）1 μL，cyp19a1a-R（10 μmol·L?1）1 μL，無菌水 8.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變 性 3 min； 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 2 min，34個循環(huán)；72 ℃ 再延伸 5 min。再根據(jù)已獲得cyp19a1a中間序列，用Oligo7.0軟件設(shè)計RACE引物，進行巢氏PCR擴增。以合成卵巢5′/3′RACE Ready cDNA為模板，使用引物cyp19a1a-5gsp1和cyp19a1a-3gsp1 與 10×Universal Primer A Mix（UPM）分別進行5′RACE和3′RACE第一次PCR擴增；取5 μL 第一次 PCR 產(chǎn)物稀釋到 245 μL 的 Tricine-EDTA作為第二次PCR模板，相應(yīng)引物為cyp19a1a-5gsp2和cyp19a1a-3gsp2 與 Universal Primer Short。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物，用DNA A-Tailing Kit試劑盒對回收目的產(chǎn)物進行末端加A處理，連接到pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，菌落PCR篩選陽性克隆并由蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。根據(jù)5′和3′端序列所包含重疊序列進行拼接，得到cyp19a1a基因全長cDNA序列。引物信息如表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers applied

1.5 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件進行cyp19a1a序列拼接，NCBI中Blast工具進行拼接序列比對，NCBI的OFR Finder工具預(yù)測開放閱讀框，Bio Edit分析核酸序列分子質(zhì)量，ExPASy-ProtParam（http://www.expasy.org/）在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，PSORTⅡPrediction（http://psort.hgc.jp/form.html）預(yù)測亞細(xì)胞定位，SignalIP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP/）在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽，TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、DeepTMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?DeepTMHMM）在線軟件預(yù) 測 蛋 白 質(zhì) 跨 膜 區(qū) ， Predict Protein（http://www.predictprotein.Org）在線軟件預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）預(yù) 測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）預(yù)測蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域。PROSITE（https://prosite.expasy.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)的功能域。在線軟件ClustalW（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ciustalo/）將蘭州鲇cyp19a1a基因編碼的氨基酸序列與其他物種進行同源性比對。用MEGA11軟件利用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6 組織表達分析

提取3齡蘭州鲇雌、雄魚和雌雄同體的腦、下丘腦、垂體、鰓、肌肉、胃、腸、心、肝、脾、腎、卵巢、精巢以及3月齡、1齡性未成熟蘭州鲇卵巢和精巢組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（方法同1.3）。根據(jù)蘭州鲇cyp19a1a基因序列設(shè)計熒光定量PCR引物（cyp19a1a-qF和cyp19a1a--qR，表1），將各組織 cDNA 稀釋為 50 ng·μL?1，以卵巢為模板進行PCR擴增驗證引物特異性及退火溫度，反應(yīng)條件同1.3。根據(jù)實驗室前期對蘭州鲇最適內(nèi)參基因的分析，選取β-actin作為內(nèi)參基因。采用SYBRGreenⅠ染料法，qPCR在qTOWER2.2型熒光定量擴增儀上進行，反應(yīng)體系為 20.0 μL：cDNA 模板 2 μL，TB Green Premix ExTaqII 10 μL，10 μmol·L?1正反引物各 0.8 μL，ddH2O 6.4 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性 30 s，95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 15 s，進行 40 個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s 反應(yīng)條件繪制熔解曲線；每個樣品均進行3次重復(fù)測定，每次設(shè)定一個無模板陰性對照以排除假陽性結(jié)果。采用2?ΔΔCT方法計算基因的相對表達量。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測

組織切片制備：將組織樣品從4%多聚甲醛溶液取出，沖洗組織塊、脫水、透明、浸蠟和包埋，制成4 μm厚石蠟切片，置于烤片機上，60 ℃烘烤6 h。免疫組織化學(xué)染色：（1）切片脫蠟至水，在pH 6.0的 0.01 mol·L?1檸檬酸鹽緩沖液微波加熱修復(fù)抗原15 min，自然冷卻至室溫。（2）滴加3%過氧化氫溶液，37 ℃作用15 min。（3）滴加正常山羊血清，室溫封閉 15 min。（4）一抗孵育，4 ℃ 過夜。（5）復(fù)溫 30 min，二抗孵育，37 ℃ 作用 15 min。（6）三抗孵育，37 ℃ 作用 15 min。（7）DAB 顯色，在顯微鏡下觀察并控制顯色，自來水終止反應(yīng)。（8）蘇木精復(fù)染1.5 min，鹽酸酒精分化，自來水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以上步驟除第三步外，其余各步驟間均用PBS洗3次，每次3 min。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟不變。照片均通過BA400 Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)進行拍攝。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用2?ΔΔCT法計算相對表達量，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，以單因素方差分析ANOVA（SPSS 25.0）進行統(tǒng)計學(xué)分析。用GraphPadPrism8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 cyp19a1a 序列的分子特征

本研究采用同源克隆和RACE方法獲得蘭州鲇cyp19a1a全長 cDNA 序列 2168 bp，包含 4 個多聚腺苷酸化信號（AATAAA），其中 5′ 非編碼區(qū)（Untranslated region，UTR）53 bp， 開 放 閱 讀 框1707 bp，3′ UTR 408 bp。Cyp19a1a 編碼 568 個氨基酸，包含20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，其中亮氨酸（Leu，12.5%）最多，谷氨酸（Glu，7.7%）、纈氨酸（Val，7.7%）次之，色氨酸（Trp，1.1%）最少。使用ExPAsy在線軟件預(yù)測Cyp19a1a蛋白分子質(zhì)量為64951.89 kD，分子式為 C2 897H4 579N801O835S30，半衰期為 30 h，理論等電點6.60，不穩(wěn)定系數(shù)為44.33，總平均親水性為?0.192。Cyp19a1a亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的概率為33.3%，位于液泡、質(zhì)膜的概率為22.2%，位于線粒體、高爾基體的概率均為11.1%。利用Signal IP對蛋白質(zhì)信號肽分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有信號肽。用TMHMM 2.0 Server預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)跨 膜螺旋數(shù) 量（Number of predicted TMHs）為0；1～568位氨基酸全部為膜外蛋白，無膜內(nèi)蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)。用DeepTMHMM對跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)存在1個跨膜螺旋區(qū)，第47～56位氨基酸（圖1）。利用 Predict Protein在線軟件對蘭州鲇Cyp19a1a蛋白二級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)Cyp19a1a蛋白中α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)卷曲所占的比例分別為40.49%、14.61%和44.89%。蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，蘭州鲇cyp19a1a基因編碼的氨基酸序列有2 個低復(fù)雜度區(qū)（Low complexity region），分別在 46～56位和513～537位。有1個P450蛋白結(jié)構(gòu)域（Pfam domain），在68～508位。用PROSITE對其功能域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在450～459位存在細(xì)胞色素P450半胱氨酸血紅素-鐵配體識別結(jié)合位點。SWISS-MODEL在線軟件對蘭州鲇cyp19a1a基因編碼蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角以及延伸鏈構(gòu)成。

圖1 蘭州鲇卵巢芳香化酶的跨膜螺旋預(yù)測Fig.1 Predicted transmembrane helices of ovarian aromatase in S.lanzhouensis

圖2 預(yù)測的蘭州鲇Cyp19a1a蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.2 Tertiary structure of Cyp19a1a in S.lanzhouensis

2.2 Cyp19a1a 蛋白多序列比對和系統(tǒng)進化分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中收集已發(fā)表的不同物種（兩棲動物、哺乳動物、爬行動物、和硬骨魚類）Cyp19a1a氨基酸序列，使用Clustal W與其他物種進行比較發(fā)現(xiàn)，在蘭州鲇cyp19a1a基因中也存在芳香化酶的5個高度保守片段，分別為跨膜區(qū)、I-螺旋區(qū)（與類固醇物質(zhì)結(jié)合有關(guān)）、Ozol’s肽區(qū)、芳香化酶特異保守區(qū)以及血紅素結(jié)合區(qū)（圖3），經(jīng)Blastx在線軟件分析發(fā)現(xiàn)Cyp19a1a氨基酸序列與南方大口鲇（Silurus meridionalis，AAP83133.1）的同源性最高（97.94%），與虎頭鯊（Pangasianodon hypophthalmus，XP_034161197.1）、斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus，NP_001316189.1）、 黃 顙 魚（Tachysurus fulvidraco，AKK31591.1）、印度囊鰓鲇（Heteropneustes fossilis，AID21725.1）、 蟾 胡 子 鲇（Clarias batrachus，AML79722.1）、塘鲺（Clarias fuscus，AFB77217.1）、尖齒胡鲇（Clarias gariepinus，ADH29765.1）等鲇形目魚類的同源性分別為90.23%、89.21%、87.62%、84.7%、83.50%、64.68%、60.23%；與大蓋巨脂鯉（Colossomamacropomum，XP_036420492.1）、紅腹白鯧（Pygocentrus nattereri，XP_017574997.2）、電鰻（Electrophorus electricus，XP_026865672.2）的同源性分別為76.70%、76.15%、74.81%；與鯉魚（Cyprinus carpio，XP_042599607.1）、 斑 馬 魚（Danio rerio，NP_571229.3） 、 稀 有 鮈 鯽（Gobiocypris rarus，ADB29065.1） 的 同 源 性為71.43%、70.66%、70.66%；與其他硬骨魚類均在60%~70%。另外，Cyp19a1a氨基酸序列與人類（Homo sapiens，NP_000094.2）、小鼠（Mus musculus，NP_001335100.1）、 兔（Oryctolagus cuniculus，NP_001164392.1）、 非 洲 爪 蟾（Xenopus laevis，BAF48355.1）的同源性均為55%左右。在Cyp19a1a氨基酸序列分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4）。系統(tǒng)進化樹表明蘭州鲇cyp19a1a基因與鲇形目魚類聚為一小支且與南方大口鲇同源性高，親緣關(guān)系最近；與兩棲動物、爬行動物、鳥類和哺乳動物同源性相對低。

圖3 不同脊椎動物的Cyp19a1a氨基酸的同源性分析Fig.3 Homology of Cyp19a1a in different vertebrates

圖4 cyp19a1a基因系統(tǒng)進化樹（NJ）Fig.4 Phylogenetic trees of cyp19a1a (Neighbor-joining)

2.3 蘭州鲇 cyp19a1a 基因組織表達分析

采用qRT-PCR方法檢測cyp19a1amRNA在蘭州鲇3齡雌魚和雄魚的腦、下丘腦、垂體、鰓、肌肉、胃、腸、心、肝、脾、腎、精巢、卵巢組織的表達。結(jié)果顯示：cyp19a1amRNA在3齡蘭州鲇雌、雄魚性腺中的表達水平最高，且卵巢的表達水平遠(yuǎn)高于精巢（P＜ 0.05），而精巢的表達水平顯著高于其他組織（P＜ 0.05），提示蘭州鲇cyp19a1amRNA的表達具有組織特異性和性別二態(tài)性（圖5）。對3月齡、1齡、3齡蘭州鲇卵巢和精巢cyp19a1amRNA的表達分析結(jié)果表明，卵巢組織中3齡個體表達水平最高，1齡的表達水平次之，3月齡的表達水平最低，各個時期之間差異顯著（P＜ 0.05）；精巢組織中3齡蘭州鲇表達水平最高且與3月齡和1齡差異顯著（P＜ 0.05），表明cyp19a1amRNA 隨著蘭州鲇性腺發(fā)育表達逐漸增強（圖6）。

圖5 cyp19a1a基因在3齡雌雄蘭州鲇不同組織表達水平Fig.5 cyp19a1a expressions in different organs of 3-year-old female and male S.lanzhouensis

圖6 蘭州鲇cyp19a1a基因在不同年齡段性腺發(fā)育差異表達Fig.6 cyp19a1a expressions during gonad development of S.lanzhouensis at different ages

2.4 Cyp19a1a 蛋白在蘭州鲇性腺中的細(xì)胞定位

通過石蠟切片確定3月齡、1齡、3齡蘭州鲇性腺發(fā)育時期，3月齡卵巢處于Ⅱ期，由少量Ⅰ時相卵原細(xì)胞和Ⅱ時相初級卵母細(xì)胞組成；1齡卵巢處于Ⅱ期，由極少數(shù)卵原細(xì)胞和初級卵母細(xì)胞（小生長期）組成；3齡卵巢處于Ⅲ期，主要由Ⅲ時相卵母細(xì)胞組成（大生長期）。3月齡精巢處于Ⅱ期，主要由Ⅱ時相初級精母細(xì)胞組成；1齡精巢處于Ⅲ期，由少量初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子組成；3齡精巢處于Ⅳ期，由少量次級精母細(xì)胞和精子組成。

利用免疫組織化學(xué)技術(shù)進行Cyp19a1a在3月齡、1齡、3齡蘭州鲇卵巢、精巢組織中的細(xì)胞定位檢測，結(jié)果顯示，3月齡、1齡卵巢中的卵原細(xì)胞呈免疫陰性反應(yīng)，而3月齡、1齡和3齡卵巢中卵母細(xì)胞都對Cyp19a1a顯免疫陽性反應(yīng)。3月齡～1齡的卵巢發(fā)育過程中初級卵母細(xì)胞免疫陽性信號逐漸增強，其主要分布于胞質(zhì)。隨著初級卵母細(xì)胞生長發(fā)育，在3齡蘭州鲇卵巢中次級卵母細(xì)胞免疫陽性反應(yīng)達到最強，其主要分布于胞質(zhì)、濾泡膜以及放射膜和鞘膜細(xì)胞。Cyp19a1a在3月齡、1齡和3齡蘭州鲇精巢中間質(zhì)細(xì)胞呈弱陽性反應(yīng)（圖7）。

圖7 Cyp19a1a在蘭州鲇卵巢和精巢的細(xì)胞定位Fig.7 Cellular localizations of Cyp19a1a in ovary and testis of S.lanzhouensis

2.5 蘭州鲇雌雄同體 cyp19a1a 基因組織表達分析

采用qRT-PCR方法檢測cyp19a1amRNA在3齡蘭州鲇雌雄同體的腦、下丘腦、垂體、鰓、肌肉、胃、腸、心、肝、脾、腎、卵巢的表達。結(jié)果顯示：cyp19a1amRNA在3齡蘭州鲇雌雄同體的性腺中表達水平最高，且卵巢的表達水平顯著高于精巢（P＜ 0.05），而精巢的表達水平顯著高于其他組織，在腦、下丘腦、垂體等組織僅檢測到微量表達，提示蘭州鲇雌雄同體cyp19a1amRNA的表達具有組織特異性（圖8）。cyp19a1amRNA在3齡蘭州鲇雌雄同體和雌雄魚性腺的表達結(jié)果顯示，雌雄同體和雌魚在卵巢中高表達，且兩者差異不顯著（P ＞0.05），而在雌雄同體和雄魚精巢的表達遠(yuǎn)低于卵巢（P＜ 0.05），且兩者精巢組織差異不顯著（P＞0.05）（圖9）。

圖8 cyp19a1a基因在3齡蘭州鲇雌雄同體不同組織表達差異Fig.8 Expression of cyp19a1a in different organs of 3-year-old hermaphroditic S.lanzhouensis

圖9 cyp19a1a基因在3齡蘭州鲇雌雄同體和雌雄異體性腺表達水平Fig.9 Expression of cyp19a1a in gonads of 3-year-old hermaphroditic and gonochoristic S.lanzhouensis

3 討論

為研究蘭州鲇性腺型芳香化酶cyp19a1a基因，從蘭州鲇卵巢組織中分離出cyp19a1acDNA全長序列。對編碼氨基酸序列進行亞細(xì)胞定位、信號肽、跨膜螺旋、疏水性/親水性以及蛋白質(zhì)一級、二級、三級結(jié)構(gòu)、保守區(qū)域進行分析，與其他脊椎動物cyp19a1a基因進行序列比對、氨基酸序列同源性以及系統(tǒng)進化樹分析，可確定所克隆基因全長是卵巢芳香化酶基因。該基因含有典型cyp19基因保守的跨膜區(qū)、Ⅰ-螺旋區(qū)（與類固醇物質(zhì)結(jié)合有關(guān)）、Ozol's肽區(qū)、芳香化酶特異保守區(qū)以及血紅素結(jié)合區(qū)。這些區(qū)域在大多數(shù)脊椎動物中高度保守，并負(fù)責(zé)CYP19的結(jié)合和催化活性?；谛蛄斜Ｊ匦?，推測cyp19基因與其他物種具有相似的結(jié)合和催化活性并且發(fā)揮著極其重要的生理功能。系統(tǒng)發(fā)育樹表明蘭州鲇cyp19a1a與南方大口鲇親緣關(guān)系最近，與其他鲇形目魚類處于同一進化分支上，說明鲇形目魚類中Cyp19a1a蛋白具有高度保守性；進化分析結(jié)果與傳統(tǒng)的分類基保持一致，符合脊椎動物的進化規(guī)律。

在脊椎動物中，cyp19a1a基因的表達模式表現(xiàn)出明顯的性別二型性。本研究通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)cyp19a1amRNA在3齡蘭州鲇雌魚卵巢中高表達，在精巢的表達量也遠(yuǎn)高于除卵巢外的其他組織。這與非洲爪蟾[31]、稀有鮈鯽[32]和黃鱔[18]等的研究結(jié)果相似。這是由于較高的cyp19a1a可以加速雌激素合成，而雌激素在魚類卵巢分化與維持等方面起著至關(guān)重要的作用[33]。Kitano等[34]在對比目魚性腺分化過程中發(fā)現(xiàn)，cyp19a1a在性腺中低表達是形成精巢的必要條件。因此推測cyp19a1a在蘭州鲇精巢低表達很可能在精巢形成和維持方面發(fā)揮了促進作用。此外，cyp19a1a在蘭州鲇腦、下丘腦、垂體、心臟、肝等組織中也有微量表達。盡管cyp19a1amRNA的主要表達部位是性腺，但其組織表達在不同魚種之間并不總是一致的。例如，cyp19a1a在斑馬魚[17]的卵巢、腦和眼中表達，在裸蓋魚（Anoplopoma fimbria）[35]的卵巢、精巢和垂體中表達，而在泥鰍[16]腦、性腺、肝臟中表達。事實上cyp19a1a表達不僅在不同的組織中、雌雄之間表現(xiàn)出不同的特異性，而且在繁殖季節(jié)與非繁殖季節(jié)、不同發(fā)育階段之間也表現(xiàn)出不同的特異性[36]。因此，本研究中cyp19a1a在蘭州鲇性腺不同發(fā)育階段的表達結(jié)果觀察到3齡蘭州鲇卵巢中cyp19a1amRNA的表達水平最高，其次是1齡，3月齡表達量最低，表明cyp19a1a可能在卵巢發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。研究表明卵巢芳香化酶的表達量決定著硬骨魚卵巢發(fā)育及其成熟[37]。而在蘭州鲇精巢中，3齡蘭州鲇精巢中cyp19a1amRNA的表達水平最高，1齡和3月齡表達量低，這一結(jié)果推測其和精巢發(fā)育過程中精子生成有關(guān)。Callard[38]在研究精子生成過程中類固醇激素的作用時發(fā)現(xiàn)，在精子生成末期，血清中雌激素早于雄激素先達到峰值或與雄激素同時達到峰值。

免疫組織化學(xué)定位分析發(fā)現(xiàn)，蘭州鲇Cyp19a1a在3月齡卵巢中的卵原細(xì)胞呈免疫陰性反應(yīng)，而在3月齡、1齡和3齡卵巢的卵母細(xì)胞顯免疫陽性反應(yīng)。Cyp19a1a在3月齡到1齡卵巢發(fā)育過程中，初級卵母細(xì)胞信號逐漸增強且主要分布在卵母細(xì)胞的胞質(zhì)；隨著初級卵母細(xì)胞的生長發(fā)育，在3齡卵巢中其信號達到最強且主要分布在初級卵母細(xì)胞的胞質(zhì)、濾泡膜以及放射膜。相關(guān)研究表明，Cyp19a1a在鳉魚（Fundulus heteroclitus）[39]、斑馬魚[40]和大西洋黃魚[41]卵母細(xì)胞中高表達，而在卵黃發(fā)生前期和卵黃發(fā)生階段的卵泡細(xì)胞層表達較少。同時，Dong等[39]發(fā)現(xiàn)Cyp19a1a的表達主要定位于鳉魚發(fā)育過程中的初級生長階段卵母細(xì)胞的卵漿中，隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育直至卵黃生成，Cyp19a1a的信號逐漸減弱。本試驗中Cyp19a1a在不同發(fā)育階段卵細(xì)胞的表達與上述卵黃發(fā)生前的卵母細(xì)胞中高表達的結(jié)果一致，表明在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中，芳香化酶高活性能夠加速催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，雌激素可以促進卵母細(xì)胞發(fā)育，刺激卵母細(xì)胞中卵黃物質(zhì)的積累，從而使卵子發(fā)育順利進行，表明芳香化酶的活性對蘭州鲇卵母細(xì)胞的生長發(fā)育有重要作用。在3月齡、1齡、3齡精巢組織中，發(fā)現(xiàn)Cyp19a1a在間質(zhì)細(xì)胞有陽性反應(yīng)，這與在斑點叉尾鮰[42]、虹鱒[43]和刺魟（Dasyatis akajei）[44]中的研究結(jié)果一致。間質(zhì)細(xì)胞能夠合成和分泌雄激素，同時也是雄激素作用的靶細(xì)胞，因此可以進一步推測cyp19a1a具有促進精巢的發(fā)育和精子發(fā)生的作用。

眾所周知，在硬骨魚類中，雌二醇和甲基睪酮是主要的雌激素和雄激素。調(diào)控這些性類固醇激素可以誘導(dǎo)許多雌雄同體發(fā)生性別轉(zhuǎn)化[33]。Devlin[33]和Kroon[45]等認(rèn)為芳香化酶（一種將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的類固醇生成酶）是調(diào)節(jié)雌雄同體、原性和雙向物種性別分化的關(guān)鍵酶。本研究通過qRT-PCR檢測cyp19a1a基因在蘭州鲇雌雄同體不同組織的表達以及雌雄同體與雌、雄魚性腺的表達對比分析，發(fā)現(xiàn)鲇雌雄同體蘭州鲇和正常蘭州鲇表達模式一致，兩者主要在是性腺中表達，且在卵巢中的表達遠(yuǎn)高于精巢。而cyp19a1a基因在雌雄同體和正常雌雄蘭州鲇性腺的表達差異均不顯著。以上結(jié)果表明，cyp19a1a基因?qū)μm州鲇雌雄魚和雌雄同體魚的調(diào)控作用是一致的。在硬骨魚中，已經(jīng)記錄了1500多種雌雄同體的魚類[46]。大多數(shù)雌雄同體魚類主要有3種性別轉(zhuǎn)變形式，即原雌體（雌魚到雄魚的性別變化）、原雄魚（雄魚到雌魚的性別變化）以及一系列的雙向性別變化[47]。相反，同時的兩性現(xiàn)象只存在于以下兩個魚種中：紅樹林鱂魚（Kyptolebias marmoratus）和 橫 帶 低 紋 鮨（Hypoplectrus nigricans）[46]。 而 Kuwamur 等[48]和Maxfield等[49]對雌雄同體雌雄同步成熟魚類研究發(fā)現(xiàn)，這種類型魚類同時具有功能性的卵巢和精巢組織，并且能夠在雌雄兩個性別間多次改變性別以應(yīng)對其社會地位的變化。沖繩磨塘鱧（Trimma okinawae）是蝦虎魚科中第一種被報道的雌雄同體雌雄同步成熟魚類。Kobayashi[50]等對沖繩磨塘鱧兩種細(xì)胞色素P450芳香化酶的特性研究中發(fā)現(xiàn)，P450芳香化酶A特異地表達于卵巢組織，其轉(zhuǎn)錄水平隨著卵母細(xì)胞的生長發(fā)育顯著增高，而在卵黃發(fā)生后迅速下降。在成熟睪丸的間質(zhì)細(xì)胞中可以檢測到P450芳香化酶A轉(zhuǎn)錄本。睪丸中芳香酶的表達與斑點叉尾鮰、虹鱒等魚的早期發(fā)現(xiàn)一致。然而，在性腺形成方式方面，這些物種與沖繩磨塘鱧的情況是不同的。沖繩磨塘鱧的獨特之處在于，無論發(fā)育處于哪個階段，其性腺中都有卵巢和精巢。Orlando等[51]對雌雄同體紅樹林鱂魚和雄性紅樹林鱂魚芳香酶基因差異表達研究中發(fā)現(xiàn)，芳香化酶A在雌雄同體紅樹林鱂魚的性腺的表達遠(yuǎn)高于雄性紅樹林鱂魚，證實其雌雄同體中存在卵巢組織。通過以上研究表明，cyp19a1a在雌雄同體魚類性腺的表達譜證實了性腺芳香化酶cyp19a1a表達水平不受基因型控制，而主要受調(diào)控雌雄激素的芳香化酶的支配。由于芳香化酶對魚類生殖調(diào)控和性腺發(fā)育的獨特作用，因此可以采取人工手段（采用雌激素誘導(dǎo)XY基因型蘭州鲇精巢逆轉(zhuǎn)為卵巢或者采用雄激素或芳香化酶抑制劑誘導(dǎo)XX基因型蘭州鲇卵巢轉(zhuǎn)為精巢）改變魚類體內(nèi)的芳香化酶的水平，從而獲得XY基因型的偽雌魚和XX基因型的偽雄魚，而XY基因型的偽雌魚和XY正常雄魚人工授精可產(chǎn)生YY雄魚，其和XY基因型的雌雄同體蘭州鲇一樣（雌雄同體自體精卵人工授精獲得YY雄性自我受精系）。YY雄性可直接作為父本與激素誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)的XY偽雌魚或者YY偽雌魚進行全雄性后代的生產(chǎn)。因此，此研究為雌雄同體以及生長速度和體型性別二態(tài)性魚類在培育全雌或全雄種群提供了理論依據(jù)。

本研究首次克隆了蘭州鲇cyp19a1a基因的cDNA全長序列及其表達模式，為探討cyp19a1a基因?qū)μm州鲇性別決定與分化、性腺發(fā)育和維持以及卵母細(xì)胞生長發(fā)育過程中的作用及機制奠定了基礎(chǔ)，對深入了解蘭州鲇性別決定與分化、性腺發(fā)育過程及其生殖調(diào)控積累資料，為后續(xù)通過基因編輯技術(shù)對性別決定與分化相關(guān)基因cyp19a1a在蘭州鲇分子性別控制育種以及應(yīng)用激素處理誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)的方式培育全雄蘭州鲇提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。