余自強(qiáng)，龔夢夢，李秋玉，陳粉粉

(西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224)

0 引言

動(dòng)物標(biāo)本是動(dòng)物學(xué)相關(guān)專業(yè)教學(xué)、科研和科普工作的重要載體[1-5]。目前，按照工藝處理和技術(shù)手段將動(dòng)物標(biāo)本分為浸制標(biāo)本、剝制標(biāo)本、骨骼標(biāo)本、干制標(biāo)本和仿真標(biāo)本等[6]。而在這些標(biāo)本制作過程中，有害物質(zhì)不可避免的存在，低毒環(huán)保材料的使用是動(dòng)物標(biāo)本制作的發(fā)展趨勢[7-8]，水晶滴膠作為新型環(huán)保材料，也被應(yīng)用于標(biāo)本的制作中[5，9]。

已有的研究表明，脂肪在雞胚胎期以皮下脂肪組織的沉積為主，雖然雞胚胎期脂肪組織生長發(fā)育的特征已有報(bào)道，但對于具有“烏皮、烏骨、烏肉”特征的烏骨雞胚胎期脂肪組織色澤和沉積部位的變化特點(diǎn)鮮有報(bào)道[10-11]。Chen等[10]應(yīng)用甲醛固定和KOH處理獲得白羽肉雞胚胎期脂肪組織的可視化標(biāo)本，可以直觀觀察胚胎期脂肪組織沉積特點(diǎn)，但有關(guān)雞胚胎期脂肪組織可視化標(biāo)本制作及可持久保存標(biāo)本的制作方法還鮮有報(bào)道。目前，雞胚胎期脂肪組織可視化標(biāo)本可使得脂肪組織整體成像成為可能[9]，而滴膠標(biāo)本應(yīng)用于動(dòng)物標(biāo)本制作也使得標(biāo)本的保存方法得到改進(jìn)[6，8，13]。本研究通過對標(biāo)本固定劑的選擇、KOH的浸泡時(shí)間和標(biāo)本保存方式等條件的摸索，提出能用于教學(xué)和研究的烏骨雞胚胎期脂肪組織可視化標(biāo)本的制作方法。通過烏骨雞胚胎期脂肪組織標(biāo)本制作，可以觀測烏骨雞胚胎期脂肪組織沉積的全過程，為烏骨雞胚胎期脂肪組織發(fā)育的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 胚胎采集

實(shí)驗(yàn)用種蛋為無量山烏骨雞種蛋，購自云南大理南澗無量山烏骨雞種禽場。種蛋稱重后依據(jù)取樣時(shí)間以組間蛋重?zé)o差異隨機(jī)分組后入孵。孵化條件參照李秋玉等[11]報(bào)道進(jìn)行。

將孵化24 h記為孵化第1日胚齡(E1)，在E11、E12、E14、E16、E18、E20和出殼當(dāng)日(D0)取發(fā)育正常的雞胚用于脂肪組織可視化標(biāo)本制作。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：多聚甲醛、氫氧化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、丙三醇等均為分析純，購自廣東光華科技股份有限公司；環(huán)氧樹膠-水晶滴膠(A膠和B膠)購自聚恒創(chuàng)電子材料有限公司；凡士林購自致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器：電腦全自動(dòng)孵化出雛機(jī)(FT-KFC4，北京春明方通電子有限公司)、單反相機(jī)(SONY-a7r3)。

1.3 方法

1.3.1 樣本固定

雞胚用新配PBS清洗3次去除其他附著物，有羽毛樣本用鑷子輕輕拔掉羽毛。將清除干凈的雞胚固定在10%甲醛或者10%多聚甲醛溶液玻璃瓶中固定24 h。

1.3.2 KOH處理

雞胚胎期皮下脂肪緊貼于皮膚之下，為保證脂肪組織完整性，參照Chen 等[10]報(bào)道方法，用1% KOH溶液浸泡固定樣本后進(jìn)行去除皮膚暴露脂肪組織的處理。

1.3.3 去皮及觀察標(biāo)本制備

從1% KOH浸泡液中取出雞胚，使用新鮮配制PBS緩沖液沖洗2次，轉(zhuǎn)移至干凈培養(yǎng)皿中使用眼科鑷進(jìn)行去皮處理。按照腹部—背部—腿部—頭部—兩翅—四肢的順序去除皮膚，用PBS緩沖液清洗去皮后的雞胚，使用濾紙吸除雞胚上殘余PBS并及時(shí)放入盛有100%甘油的培養(yǎng)皿中觀察和拍照。

1.3.4 滴膠標(biāo)本制備

按照準(zhǔn)備—打底—固定—封樣—封頂—打磨拋光等6個(gè)步驟進(jìn)行[12-13]。①清洗烘干模具備用，制備標(biāo)本前在模具內(nèi)部涂抹一薄層凡士林便于脫模。②將環(huán)氧樹膠-水晶滴膠混合液(A膠：B膠=2.5:1)倒入模具中高2～3 mm用來打底，室溫(10℃～20℃)通風(fēng)處風(fēng)干24 h。③將處理好的雞胚放入模具中并擺好姿勢，倒入適量(能使雞胚固定)現(xiàn)配的環(huán)氧樹膠-水晶滴膠混合液，室溫(10℃～20℃)通風(fēng)處風(fēng)干24 h。④向模具中加入現(xiàn)配的環(huán)氧樹膠-水晶滴膠混合液直到淹沒雞胚全身各處，室溫(10℃～20℃)通風(fēng)處風(fēng)干24 h。⑤再次倒入現(xiàn)配的環(huán)氧樹膠-水晶滴膠混合液高出標(biāo)本2～3 mm封頂，室溫(10℃～20℃)通風(fēng)處風(fēng)干24 h。⑥取出固化好的標(biāo)本進(jìn)行打磨拋光即完成樹膠標(biāo)本制備。

2 結(jié)果與分析

2.1 多聚甲醛可替代甲醛做固定劑

鑒于甲醛具有揮發(fā)性強(qiáng)及對操作者健康的影響，嘗試使用10%多聚甲醛溶液替代10%甲醛溶液做固定液[14-16]。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，E14胚齡脂肪組織已經(jīng)可以清晰看到分布部位及脂肪組織可以分離，所以選用E14胚齡胚胎比較不同固定液對胚胎的固定效果。如圖1所示，10%多聚甲醛溶液(圖1A)和10%甲醛溶液(圖1B)對去皮的難易程度和制作標(biāo)本的質(zhì)量無明顯差別，僅從脂肪組織顏色上看，10%多聚甲醛溶液(圖1A)做固定液處理的標(biāo)本更接近于組織本身固有色澤。所以，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用10%多聚甲醛溶液作為固定液。

A 10%多聚甲醛溶液固定標(biāo)本 B 10%甲醛溶液固定標(biāo)本

2.2 KOH處理時(shí)間隨胚齡增加而加長

在標(biāo)本制作中，皮膚剝離是最關(guān)鍵的步驟。1% KOH處理的時(shí)間過短，皮膚未和組織發(fā)生解離則皮膚很難剝離干凈；處理的時(shí)間過長，則部分皮膚潰爛，影響脂肪組織完整性，也很難全部剝離皮膚。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)摸索，發(fā)現(xiàn)隨著胚齡增加，羽毛逐漸長出，皮膚需要用1% KOH處理的時(shí)間逐漸增加。如表1所示，在E11-E14胚齡使用1% KOH處理24 h即可實(shí)現(xiàn)輕松剝皮；E16胚齡的處理時(shí)間需要延長至36 h；E18胚齡開始則需要處理48 h。

表1 不同胚齡1% KOH浸泡的參考時(shí)間

2.3 脂肪組織可視化的呈現(xiàn)

將剝皮處理后的標(biāo)本用PBS緩沖液清洗干凈，置于甘油中保存，可觀察脂肪組織的沉積部位情況，并可進(jìn)行拍照，清楚記錄脂肪沉積情況。由圖2可以看出，在E11已有少量脂肪組織沉積于頸部和腿部，但無法分離完整的脂肪組織；E12腿部的脂肪組織可以分離，且隨著胚齡的增加，脂肪的沉積量也在增加(E14-D0)，脂肪組織從最初的頸部和腿部到胸部和腹部均有分布，且主要集中在頸部和腿部。脂肪組織顏色不同于成年無量山烏骨雞脂肪組織呈褐色或者黑色，在胚胎期還無黑色素沉積于脂肪組織中，脂肪組織呈白色。

圖2 不同孵化胚齡脂肪組織的沉積變化

2.4 滴膠標(biāo)本可永久保存

含脂肪標(biāo)本在甘油中只能短期存儲，其余傳統(tǒng)保存方法多用液體試劑。而滴膠標(biāo)本作為新型標(biāo)本保存方法之一，兼具了保存性和藝術(shù)性，本實(shí)驗(yàn)中嘗試引入用滴膠固化保存胚胎期標(biāo)本，并發(fā)現(xiàn)該方法可進(jìn)行胚胎期脂肪組織可視化標(biāo)本的永久保存(見圖3)。從滴膠標(biāo)本制作的結(jié)果來看，因胚胎標(biāo)本在膠中形態(tài)不容易固定，很難統(tǒng)一成相同姿態(tài)；脂肪組織顏色發(fā)生輕微變化且組織量增加顏色變化明顯(見圖3，E16～E20)；并且因?yàn)橹谱鬟^程中進(jìn)膠問題，有可能膠中氣泡過多從而使標(biāo)本清晰度受到影響(見圖3，E20)。

圖3 不同孵化胚齡滴膠標(biāo)本

3 討論

動(dòng)物標(biāo)本制作的固定劑選擇方面，多聚甲醛可替代甲醛作為固定液[14-15]。Chen 等[10]在制作白羽肉雞胚胎期脂肪組織的可視化標(biāo)本時(shí)應(yīng)用甲醛做固定，但由于甲醛固定液具有極強(qiáng)的刺激性和腐蝕性，人吸入散發(fā)的甲醛氣體會(huì)有中毒、過敏、哮喘、肺功能損害等危害[8，16]，而多聚甲醛是一種甲醛脫水縮聚而成的固態(tài)甲醛，與甲醛水溶液相比，多聚甲醛屬于溫和型固定劑，其揮發(fā)性氣味小，固定后的細(xì)胞或組織收縮性較小，背景清晰度較高[14-15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用10%多聚甲醛溶液固定雞胚胎效果良好。

環(huán)氧樹膠-水晶滴膠是目前滴膠標(biāo)本制作的常用試劑，其主要成分包含高純度環(huán)氧樹脂和固化劑，以及部分其他物質(zhì)共同組成，用作標(biāo)本固化使得標(biāo)本耐腐蝕、晶瑩剔透，很好地保護(hù)標(biāo)本的同時(shí)還能增加標(biāo)本的藝術(shù)效果[17-18]。由于費(fèi)用較高，滴膠標(biāo)本初期常見于植物和昆蟲工藝品制作使用[13，18]。近年來，在昆蟲學(xué)、植物學(xué)及中藥學(xué)等實(shí)驗(yàn)教學(xué)標(biāo)本制作中也得到廣泛使用，但在動(dòng)物標(biāo)本制作中報(bào)道較少[5，9，13，18]。本次實(shí)驗(yàn)選用的雞胚個(gè)體較大，所以滴膠固定標(biāo)本的固化時(shí)間較昆蟲和植物標(biāo)本相比用時(shí)較長[5，18]。除進(jìn)行科學(xué)研究外，雞胚胎期脂肪組織制成滴膠固化標(biāo)本，可以立體呈現(xiàn)標(biāo)本特征、無毒無害、便于保存和用于教學(xué)。

4 結(jié)論

在胚胎期脂肪組織可視化標(biāo)本的制作中多聚甲醛可替代甲醛作為固定液；滴膠材料引入動(dòng)物標(biāo)本制作，可使制成的胚胎期脂肪組織可視化標(biāo)本實(shí)現(xiàn)立體及無毒害物質(zhì)存在的永久保存。