朱富平，劉紅強，常 清，冷偉業(yè) (重慶市第九人民醫(yī)院普外一科，重慶 400700)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴重威脅人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是HCC發(fā)生最主要的流行病學因素，80%以上的HCC患者存在HBV感染史[2]。因此，臨床亟需尋找評估HBV-HCC發(fā)生發(fā)展和預后的可靠預測因子和潛在治療靶點。外泌體是一類小的、包含大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等的細胞外囊泡，是細胞間重要的信號通訊工具[3-4]。有研究證實，腫瘤細胞分泌的miR-222-3p可在循環(huán)外泌體中富集，促進上皮性卵巢癌[5]、非小細胞肺癌[6]等腫瘤的惡性發(fā)展。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染衍生的外泌體可通過抑制Akt/mTOR通路促進病毒復制，這與miR-222-3p的高表達有關(guān)。Sun等[8]也證實HBV感染進一步促進了miR-222-3p的表達，并通過miR-222-3p介導的THBS1下調(diào)促進HCC的進展。因此，我們推測血清外泌體miR-222-3p有望成為HBV-HCC診斷中的非侵入性生物標志物，然而目前尚缺乏相關(guān)的臨床證據(jù)?；诖?，本研究通過分析HBV-HCC患者血清外泌體miR-222-3p表達水平及與患者臨床特征和預后的相關(guān)性，以期為尋找可靠的生物標志物和改進臨床治療策略提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2012年1月至2017年11月我院普外科收治的604例HCC患者的臨床病理資料，包括391例HBV-HCC患者(男242例，女149例，年齡38～89歲)和213例非HBV-HCC患者(男135例，女78例，年齡40～88歲)。納入標準:經(jīng)病理檢查證實為HCC，符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[9]診斷標準；首次確診，既往未行任何相關(guān)抗癌治療；HBV-HCC患者HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)檢測呈陽性，非HBV-HCC患者無慢性HBV感染史；具有完整臨床、實驗室、影像學相關(guān)資料。另選取288例慢性乙肝患者作為HBV組，患者有HBV感染史，HBsAg檢測呈陽性。排除標準:丙型肝炎病毒或其他病毒性肝炎感染史；合并其他惡性腫瘤；有肝切除術(shù)、遠處轉(zhuǎn)移、肝動脈化療栓塞術(shù)、腫瘤消融或抗病毒治療史；心、肺、腎等器官嚴重功能障礙；自身免疫性疾?。缓喜⑵渌腥拘约膊?；代謝、精神疾??；妊娠或哺乳期育齡患者；非原發(fā)病灶。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(2012003)，所有患者及家屬均對本研究知情，并簽署書面知情同意書。

1.2 觀察指標

收集所有患者的一般資料，包括年齡、性別、Child-Pugh分級、巴塞羅那臨床肝癌(Barcelona clinic liver cancer，BCLC)分期、治療方法等，以及生化資料。采集所有患者清晨空腹靜脈血5 mL置于抗凝管中，于4 ℃下4 000 r/min離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測患者α-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、異常凝血酶原(des-gamma-carboxy prothrombin，DCP)水平，試劑盒均購自上海將來實業(yè)股份有限公司。采用日立7600-20全自動生化分析儀檢測患者血小板計數(shù)(platelet count，PLT)、總膽紅素(total bilirubin，TBil)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotranseferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、白蛋白(albumin，ALB)水平。采用SysmexCA-1500全自動血凝儀檢測凝血酶原活動度(prothrombin activity，PTA)。所有檢測均由對研究終點不知情的技術(shù)人員進行。

1.3 血清外泌體miR-222-3p檢測

取0.5 mL血清樣本于4 ℃下3 000 r/min離心10 min，使血細胞下降，然后12 000 r/min離心10 min，去除殘留的細胞碎片。用全血清外泌體分離試劑盒(美國Invitrogen公司)從血清中分離純化血清外泌體，并將外泌體顆粒重懸于磷酸鹽緩沖液中，-80 ℃保存。取血清外泌體置于formvar涂層的銅—鈀網(wǎng)格上，固定后用3%磷鎢酸染色，通過100XCII透射電鏡(日本JEOL公司)觀察外泌體的大小和形態(tài)特征，并用NanoSight納米粒徑追蹤分析儀確定外泌體顆粒粒徑分布和相對濃度。采用Western blot法檢測血清外泌體樣本中CD63、TSG101、Alix表達，抗體均購自美國Abcam公司。用ExoQuick?外泌體提取和TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)提取外泌體總RNA，通過PrimeScript RT試劑盒(日本Takara公司)進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄后使用SYBR Green Real Time PCR試劑盒(日本Takara公司)在Applied Biosystems 7300型PCR系統(tǒng)上進行實時熒光定量PCR反應(yīng):95 ℃ 2 min，40個擴增周期(95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 30 s)，每個周期后測量熒光曲線，平行進行3次。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-222-3p的相對表達量。引物序列:miRNA-222-3p的正向引物序列為5’-CTCAGTAGCCAGTGTAG-3’、反向引物序列為5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；U6的正向引物序列為5’-ACAGATCTGTCGGTGTGGTGGCAC-3’、反向引物序列為5’-GGCCCCGGATTATCCGACATTC-3’。

1.4 隨訪

隨訪時間為第1年每3個月1次，第2年每4個月1次，第3年每6個月1次，之后每1年1次，隨訪的截止時間是2022年1月或者患者死亡時，記錄患者死亡情況。定期檢測患者腫瘤和HBV的血清標志物，并根據(jù)需要進行腹部造影、超聲、肝動脈造影或侵襲性檢查?？偵嫫诙x為手術(shù)日期至隨訪截止時間或患者死亡時間。

1.5 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 26.0軟件處理數(shù)據(jù)，二分類變量以率(%)表示，采用χ2檢驗；連續(xù)變量先進行K-S正態(tài)性檢驗和方差齊性分析，文中所有連續(xù)變量均不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)和四分位數(shù)表示，采用Mann-WhitneyU或Kruskal-WallisH檢驗。繪制受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic，ROC)曲線，并計算曲線下面積(areaunderthecurve，AUC)以評估血清外泌體miR-222-3p對HBV-HCC的診斷價值。采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗分析miR-222-3p表達水平與患者預后的相關(guān)性。采用Cox比例風險回歸模型分析影響HBV-HCC患者預后的危險因素。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料比較

3組患者年齡、性別、ALB比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而非HBV-HCC組和HBV-HCC組患者血清AST、ALT、TBil、AFP、DCP水平均高于HBV組，同時血清PTA、PLT顯著低于HBV組(P<0.05)；HBV-HCC組和非HBV-HCC組患者Child-Pugh分級、BCLC分期、治療方法比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 患者一般資料比較

2.2 血清外泌體獲取及鑒定

用超速離心法從患者的血清中提取并純化得到雙層膜結(jié)構(gòu)的球形或橢球型的外泌體，用透射電鏡觀察，顆粒分布均勻，粒徑大小為40～100 nm。納米粒徑追蹤技術(shù)顯示，外泌體粒徑主要為0～300 nm。經(jīng)Western blot法檢測，這些顆粒高表達CD63、TSG101、Alix，見圖1。

a:納米粒徑追蹤分析法分析血清外泌體的大小分布；b:血清外泌體的透射電鏡圖；c:Western blot法檢測血清外泌體特征蛋白CD63、TSG101和Alix表達圖1 血清外泌體特征鑒定

2.3 血清外泌體miR-222-3p水平比較

HBV組、非HBV-HCC組和HBV-HCC組患者血清外泌體miR-222-3p水平分別為1.0(0.8,1.2)、1.4(1.0,1.7)、1.6(1.3,2.1)，差異有統(tǒng)計學意義(H=217.064，P<0.001)。HBV-HCC組患者血清外泌體miR-222-3p水平顯著高于非HBV-HCC組和HBV組(P<0.001)。經(jīng)ROC曲線分析，血清外泌體miR-222-3p用于HBV-HCC診斷(HBV-HCC組vs.HBV組、HBV-HCC組vs.非HBV-HCC組)的AUC分別為 0.817(95%CI:0.786～0.847)、0.672(95%CI:0.632～0.712),見圖2。根據(jù)ROC曲線得到最佳截斷值，當血清外泌體miR-222-3p≥1.4時，用于區(qū)分HBV-HCC和HBV的準確性為88.7%，陽性似然比為8；當血清外泌體miR-222-3p≥1.7時，用于區(qū)分HBV-HCC和非HBV-HCC的準確性為79.0%，陽性似然比為3.5。

a:HBV-HCC組 vs.HBV組；b:HBV-HCC組 vs.非HBV-HCC組圖2 血清外泌體miR-222-3p診斷HBV-HCC的ROC曲線

2.4 miR-222-3p表達與HBV-HCC患者不同臨床特征的關(guān)系

根據(jù)血清外泌體miR-222-3p中位值1.6將HBV-HCC患者分為高表達組和低表達組，血清外泌體miR-222-3p的表達與患者HBV-DNA拷貝、AST、DCP、BCLC分期有關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別、HBsAg、ALT、TBil、ALB、PTA、PLT、AFP、治療方法、Child-Pugh分級無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 血清外泌體miR-222-3p表達與HBV-HCC患者不同臨床特征的關(guān)系[例(%)]

2.5 miR-222-3p水平與HCC患者預后的關(guān)系

對于HBV-HCC患者，血清外泌體miR-222-3p高表達組和低表達組中位生存時間分別為2.66年、4.14年，總生存率分別為32.8%(64/195)、35.7%(70/196)，經(jīng)Log-rankχ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.078，P<0.001)，見圖3a。對于非HBV-HCC患者，血清外泌體miR-222-3p高表達組和低表達組中位生存時間分別為4.05年、3.37年，總生存率分別為34.8%(24/69)、41.0%(59/144)，經(jīng)Log-rankχ2檢驗，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，圖3b。

a:HBV-HCC患者；b:非HBV-HCC患者圖3 Kaplan-Meier曲線

2.6 Cox回歸分析影響HBV-HCC患者預后的危險因素

經(jīng)單因素和多因素Cox比例風險回歸模型分析，年齡較大、BCLC分期較晚及AST、TBil、ALB、AFP、血清外泌體miR-222-3p水平較高是影響HBV-HCC患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 Cox回歸分析影響HBV-HCC患者預后的危險因素

3 討論

HBV感染是HCC發(fā)生的原因之一，也是最嚴重和最普遍的慢性病毒感染，患者的預后通常較差[2]。因此，迫切需要尋找新的診斷或預后生物標志物和潛在的治療靶點。本研究結(jié)果顯示，HBV-HCC組的血清外泌體miR-222-3p水平較非HBV-HCC組和HBV組顯著升高，其高表達與患者不良預后密切相關(guān)，提示miR-222-3p可作為HBV-HCC早期診斷或潛在治療靶點的分子生物學指標。

外泌體是由包括癌細胞在內(nèi)的大多數(shù)細胞分泌的小膜泡，其通過傳遞活性生物分子在調(diào)節(jié)細胞間通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而影響腫瘤細胞生長、血管生成、轉(zhuǎn)移和其他生物過程[3]。miRNA是一類長度約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，主要通過與mRNA 3’非翻譯區(qū)結(jié)合并觸發(fā)mRNA降解或翻譯抑制來調(diào)節(jié)基因的表達[5]。外泌體中的miRNA相對穩(wěn)定，可防止細胞外核糖核酸酶降解。因此，外泌體miRNA可作為各種惡性腫瘤診斷和預后的非侵入性生物標志物。血清外泌體高度富集miRNA，外泌體可以在細胞間轉(zhuǎn)移miRNA，從而影響HCC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。越來越多的證據(jù)表明，外泌體中miRNA的失調(diào)會導致HBV-HCC的發(fā)生和進展，如HBV-HCC患者血清miR-125b、miR122水平下調(diào)[10-11]，而miR-210-3p水平上調(diào)[12]，這些都可能成為HBV-HCC的候選生物標志物。本研究中，血清外泌體miR-222-3p在區(qū)分HBV-HCC和非HBV-HCC或HBV-HCC和HBV時具有較高的準確性，而且其高表達與HBV-HCC患者HBV-DNA拷貝、BCLC分期有關(guān)，說明HBV感染可能增強了miR-222-3p的表達，進而促進疾病進展。

有研究發(fā)現(xiàn)，miR-222-3p在各種腫瘤細胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如miR-222-3p可促進腫瘤細胞遷移和侵襲，抑制細胞凋亡，并與腎細胞癌患者的不良預后相關(guān)[13]。吳俊藝等[14]發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-222-3p在HCC中異常高表達，并與HCC患者的不良預后密切相關(guān)，但并未分析miR-222-3p與肝炎病毒感染的關(guān)系。一些基礎(chǔ)研究顯示，miR-222-3p過表達對肝癌細胞的生長有促進作用[15-19]。本研究結(jié)果顯示，血清外泌體miR-222-3p的表達與非HBV-HCC組患者的預后無關(guān)，但是血清外泌體miR-223-3p表達與HBV-HCC患者BCLC分期有關(guān)，特別是在BCLC C分期(晚期)和D分期(終末期)患者中，miR-223-3p水平升高更為常見；Kaplan-meier生存分析也顯示，HBV-HCC患者miR-222-3p高表達患者總生存率明顯低于miR-222-3p低表達患者，且血清外泌體miR-222-3p水平升高是影響HBV-HCC患者預后的獨立危險因素。以上結(jié)論說明miR-222-3p可能在HBV-HCC中起到促癌作用。以前的體外研究已經(jīng)報道了miR-223-3p在HBV-HCC細胞中的作用，如Sun等[8]發(fā)現(xiàn)HBV可誘導miR-222-3p表達上調(diào)，而miR-222-3p又進一步通過直接結(jié)合THBS1 mRNA的3’非翻譯區(qū)并充當其競爭性內(nèi)源性RNA，上調(diào)THBS1促進HCC增殖并抑制細胞凋亡。Bandopadhyay等[16]鑒定了HBV感染中miRNAs差異性表達譜，證實外泌體miR-222表達增加。HBV X蛋白與HCC的發(fā)生有關(guān)，HBV X蛋白通過與p53的直接相互作用，調(diào)節(jié)細胞過程，如減少DNA修復和抑制p53介導的凋亡[17]。此外，據(jù)報道，HBV X蛋白可上調(diào)miR-222，而miR-222過表達直接導致腫瘤抑制基因和細胞周期調(diào)節(jié)因子p27的下調(diào)[18]，這也解釋了本研究中血清外泌體miR-222-3p水平與HBV DNA拷貝呈正相關(guān)。因此，miR-222-3p可能是HBV-HCC良好的預后生物標志物。

綜上，血清外泌體miR-222-3p與HBV-HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是影響HBV-HCC患者預后的一個獨立危險因素，血清外泌體miR-222-3p表達水平升高預示著HBV-HCC患者預后不良，因此，血清外泌體miR-222-3p可作為HBV-HCC早期診斷或治療靶點的候選生物標志物。但本研究仍處于初步探索階段，樣本量較小且血清外泌體miR-222-3p在HBV-HCC中的潛在機制尚未闡明，具有一定局限性，仍需要更多的臨床研究來進一步證實。