王 朋,付劍惠,劉琦琦,張新毅,王 慧,郭 莉,孫健淇,崔凌志 (.內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科，內蒙古 包頭 04030;.包頭市腫瘤醫(yī)院藥劑科，內蒙古 包頭 04030)

目前原發(fā)性肝癌已成為全世界最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一[1]。肝癌的發(fā)病率及病死率均居所有惡性腫瘤的前三位[2-5]。原發(fā)性肝癌作為一種高發(fā)病率、高病死率且病情隱匿的疾病，對其檢測、診斷、治療及患病機制進行研究具有非常重要的意義[6-7]。

目前，甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是臨床上診斷原發(fā)性肝癌血清標志物的“金標準”。Collier等[8]的研究表明，AFP水平在20 ng·mL-1為篩查原發(fā)性肝癌的臨界值，但AFP診斷肝癌的敏感度僅為40%～80%，特異性為49%～91%。這主要是因為AFP的合成需要在特定的細胞周期內，當AFP的基因表達低甲基化時，肝癌表現為AFP陽性；而在轉錄后翻譯前AFP表達調控停止時，則肝癌表現為AFP陰性，這在一定程度上影響了AFP的臨床應用。對腫瘤直徑小于2 cm的原發(fā)性肝癌患者，AFP的敏感度則更低。目前原發(fā)性肝癌診斷標志物的研究大多停留在實驗室階段，α-L-巖藻糖苷酶(α-L-fucosidase,AFU)與AFP及B超聯合檢測，可將肝癌診斷的特異性提高至95%[9-10]。

人胎球蛋白A(α2-Heremans-Schmid glycoprotein,AHSG)全長約為1.5 kb，由A鏈和B鏈組成，具有高度的遺傳多態(tài)性，基因型的不同可導致AHSG轉錄、表達和分泌水平的不同[11]。有研究表明AHSG具有抑制腫瘤生長的作用，可與腫瘤中的特異性細胞因子結合，抑制結合于細胞表面的受體表達，從而抑制細胞的轉化[12-13]。

本研究采用酶聯免疫法檢測原發(fā)性肝癌、肝硬化和其他肝病患者的AHSG水平，探討AHSG的活性與肝病嚴重程度的相關性，同時探討AHSG和AFP聯合檢測在原發(fā)性肝癌中的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

TBA120FR全自動生化分析儀，MK3酶標儀，E601化學發(fā)光分析儀，ECLIA-IIS化學發(fā)光免疫分析儀，湘儀L550離心機，全自動洗板機，振蕩器。

1.2 試劑

AFU檢測試劑盒、質控品及其校準品均由寧波美康生物科技股份有限公司提供；AHSG及其校準品由廈門研科生物技術有限公司提供；丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、γ-谷氨酰轉肽酶(gamma-glutamyl transpeptidase，GGT)檢測試劑盒、質控品及其校準品均由貝克曼庫爾特公司提供；乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)檢測試劑盒及其校準品由美國羅氏診斷公司提供；癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖類抗原125(carcinoembryonic antiten，CA125)、糖類抗原199(carcinoembryonic antiten，CA199)、AFP檢測試劑盒及其校準品由北京華科泰生物技術有限公司提供。

1.3 標本收集

收集內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院(簡稱包醫(yī)二附院)2016年6月至2019年12月169例肝病住院患者的血清，其中原發(fā)性肝癌患者61例，年齡47～67歲，平均(56.9±9.6)歲，男35例，女26例；肝硬化患者63例，年齡18～75歲，平均(58.7±11.0)歲，男39例，女24例；其他肝病(包括肝損傷、肝腫物、肝占位和肝功能異常)患者45例，年齡18～75歲，平均(58.8±13.5)歲，男30例，女15例。原發(fā)性肝癌的診斷參照2011年版《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》，肝硬化的診斷結合肝活檢、影像學檢查及實驗室檢查等。采集包醫(yī)二附院同期30例體檢中心健康人員的血清作為對照組。排除標準：①合并嚴重的心、肺、腎疾?。虎诤喜⒚庖咝约膊?、嚴重感染性疾病、血液病、內分泌系統(tǒng)疾病及其他惡性腫瘤；③妊娠；④酒精性肝病和丙型肝炎病毒引起的肝病。

1.4 酶聯免疫法檢測AHSG活性

將AHSG檢測試劑盒從冰箱取出，室溫放置30 min，設置校準品孔和待測樣本孔，分別加入AHSG校準品和待測樣本100 μL，混勻后蓋上板貼，37 ℃溫育 2 h。棄去孔內液體，甩干，不必洗板。每孔加入生物素標記抗體工作液100 μL，蓋上新板貼，37 ℃溫育1 h。棄去孔內液體，甩干，使用自動洗板機洗板3次，扣干。每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100 μL，蓋上新板貼，37 ℃溫育1 h。棄去孔內液體，甩干，再使用自動洗板機洗板5次，扣干。每孔依次加入底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色5 min；每孔依次加入終止溶液50 μL，終止反應。在酶標儀450 nm波長處依次測量各孔的光密度(OD)值。

1.5 化學發(fā)光法檢測AFP活性

AFP檢測試劑盒內取出包被板，分別加入25 μL的AFP校準品和待測樣品，再分別向孔內加入150 μL標記物，充分震蕩后，37 ℃溫育30 min，用稀釋后的洗滌液洗板5次，最后將包被板在干凈的濾紙上扣干。再分別加入發(fā)光底物100 μL，瞬時震蕩后立即檢測。

1.6 其他項目的檢測

采用全自動生化分析儀檢測AFU、ALT、GGT、AST、ALP水平。采用化學發(fā)光法檢測CEA、CA125、CA199、HBsAg水平。

1.7 標準曲線的繪制

校準品以6 000 r/min離心30 s，用1 mL樣本稀釋液溶解，放置備用。取7個1.5 mL離心管依次排列，各加入250 μL樣本稀釋液。吸取250 μL校準品到第1個離心管，再從第1個離心管吸取250 μL到第2個離心管，以此類推進行校準品的倍比稀釋。將校準品減去空白孔數值后繪制曲線，以校準品的濃度為縱坐標，OD值為橫坐標，繪制出標準曲線。

1.8 Child-Pugh評分評估肝功能分級

根據患者的基線信息，結合肝性腦病、腹水、凝血酶原時間、血清白蛋白及血清總膽紅素5個指標計算Child-Pugh評分，其中每項1～3分，將5個指標得分相加。根據Child-Pugh評分進行分級，分級標準：A級為5～6分；B級為7～9分；C級為10～15分。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用IBM SPSS Statistics 20 統(tǒng)計學軟件進行數據分析。AHSG水平與患者Child-Pugh分級的相關性采用Pearson分析；各組檢測數據偏態(tài)分布用中位數(四分位數間距)[M(P25～P75)]表示，采用Mann-WhitneyU檢驗進行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；多組間比較采用單因素方差分析；計算每個指標單獨及聯合診斷的ROC曲線下面積(areaunderthecurve,AUC)用于診斷效能的評價；以Youden指數最大時為最佳Cut-off值，計算敏感度和特異性。

2 結果

2.1 不同Child-Pugh分級患者AHSG水平比較

Child-Pugh分級結果顯示，61例肝癌患者中，A級有40例(65.6%)，B級有20例(32.8%)，C級有1例(1.6%)；63例肝硬化患者中，A級有41例(65.1%)，B級有22例(34.9%)；45例其他肝病患者中，A級有36例(80.0%)，B級有9例(20.0%)。其中肝癌組Child-Pugh分級B級患者的AHSG水平高于A級，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 不同Child-Pugh分級患者AHSG水平比較(ng·mL-1)

2.2 各組實驗室檢測結果比較

肝癌組的AHSG、AFP、CEA水平高于肝硬化組、其他肝病組和對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；肝癌組的AST、GGT和ALP水平均高于肝硬化組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；肝硬化組的AFP、ALT、AST、GGT、ALP水平低于其他肝病組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；肝硬化組的AHSG、AFU、CA199、CA125、AST、ALP水平高于對照組，AFP水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；肝癌組與肝硬化組的AFU、CA199、CA125、ALT水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；肝硬化組和其他肝病組的AHSG、AFU、CEA、CA199、CA125水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組實驗室檢測結果比較[M(P25～P75)]

2.3 AHSG診斷原發(fā)性肝癌的分析

肝癌組AHSG的平均水平(中位數)明顯高于肝硬化組、其他肝病組和對照組，肝癌組AHSG的波動程度也比其他3組要大(圖1)。ROC曲線結果顯示，AHSG、AFP、AFU和CEA單獨檢測的AUC(95%CI)分別是0.707(0.618～0.797)、0.885(0.824～0.946)、0.649(0.618～0.797)、0.675(0.588～0.763)，P值分別是0.000、0.000、0.001、0.000，AHSG和AFP聯合檢測的AUC(95%CI)是0.900(0.845～0.955)，P=0.000，AHSG、AFP、AFU三者聯合檢測的AUC(95%CI)是0.900(0.845～0.955)，P=0.000，而AHSG、AFP、AFU、CEA聯合檢測的AUC(95%CI)是0.906(0.853～0.960)，P=0.000，見圖2。

*:提示極端值，在AHSG試劑盒檢測線性范圍內圖1 各組AHSG水平比較

圖2 AHSG診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線分析

2.4 AHSG、AFP、AFU和CEA單獨及聯合檢測診斷原發(fā)性肝癌

以原發(fā)性肝癌診斷作為因變量，將AHSG、AFP、AFU和CEA作為連續(xù)型變量進行多因素Logistic回歸分析，以Youden指數最大時為最佳Cut-off值，每個單獨檢測項目取3個濃度進行敏感度和特異性的比較。結果顯示單獨使用AHSG作為診斷原發(fā)性肝癌標志物的最佳Cut-off值為100 ng·mL-1，敏感度達60.7%，特異性達81.5%；單獨使用AFP作為診斷原發(fā)性肝癌標志物的最佳Cut-off值為10 ng·mL-1，敏感度達80.3%，特異性達89.9%；AHSG和AFP聯合檢測診斷原發(fā)性肝癌的敏感度達80.3%，特異性達90.8%；AHSG、AFP、AFU三者聯合檢測及AHSG、AFP、AFU、CEA四者聯合檢測診斷原發(fā)性肝癌的敏感度均為80.3%，特異性均為90.8%，見表3。因此，AHSG和AFP聯合檢測用于診斷原發(fā)性肝癌明顯優(yōu)于4個項目的單獨檢測[0.900(95%CI:0.845～0.955)]。

表3 診斷原發(fā)性肝癌的4個檢測項目Cut-off值、敏感度和特異性比較

3 討論

原發(fā)性肝癌是一種發(fā)病隱匿、惡性程度高的惡性腫瘤，其無特異性的癥狀或體征；超過50%的原發(fā)性肝癌患者在初次就診時就己進入中晚期，失去根治性治療的機會，只有少數的患者能夠在早期診斷。診斷原發(fā)性肝癌的腫瘤標記物較多，但缺乏診斷敏感度和特異性都較高的標志物，需多個項目聯合檢測以彌補單個檢測項目敏感度或特異性低的缺陷。原發(fā)性肝癌篩查和輔助診斷最常用的血清學標志物包括AFP、AFU和CEA，其中AFP診斷的專一性僅次于病理檢查[14-15]。已有文獻報道，當AFP臨界值為20 ng·mL-1時，AFP診斷肝癌的敏感度達65%，特異性達94%，但AFP用于原發(fā)性肝癌早期診斷的假陰性率很高，在45%左右，當肝癌進展到晚期時，AFP表達量超過檢測線性范圍，也會出現假陰性，這會對臨床醫(yī)師的診斷造成一定的影響[16]。既往研究表明，在腫瘤患者的血清中常常能夠檢測出AHSG自身抗體，在腫瘤的生長過程中都會有一個合成AHSG的子集，從而推測AHSG可能是腫瘤生長的最早指標之一[17-18]。因此，本研究將AHSG作為主要標志物，同時選擇了3個濃度梯度并分別聯合AFP、AFU和CEA對原發(fā)性肝癌進行診斷。

本研究評估了AHSG、AFP、AFU和CEA 4種腫瘤標記物在原發(fā)性肝癌、肝硬化、其他肝病診斷中的有效性，同時對腫瘤標記物進行單獨和聯合診斷疾病的敏感度和特異性了分析和比較，結果顯示，肝癌組患者的血清AHSG水平明顯高于肝硬化組和其他肝病組，表明AHSG對于診斷肝癌具有重要的臨床意義。Child-Pugh分級結果顯示，肝癌組B級患者的AHSG水平高于A級，C級由于標本數量的限制不作比較，初步提示AHSG水平與肝病的嚴重程度相關。本研究將AHSG、AFP、AFU和CEA進行單獨及聯合檢測，ROC曲線結果顯示，聯合檢測的AUC顯著優(yōu)于單獨檢測，因此在原發(fā)性肝癌診斷上建立合理的多指標檢測模型有利于提高其準確性。

本研究選擇了3個濃度梯度并分別聯合AFP、AFU和CEA對原發(fā)性肝癌進行診斷，Youden指數計算結果顯示，AHSG診斷原發(fā)性肝癌的最佳Cut-off值是100 ng·mL-1，其敏感度為60.7%，特異性為81.5%；而單獨使用AFP作為診斷原發(fā)性肝癌標志物的最佳Cut-off值為10 ng·mL-1，敏感度達80.3%，特異性達89.9%，比文獻[8]報道的20 ng·mL-1效果好。而腫瘤標記物聯合檢測結果顯示，聯合檢測的敏感度和特異性優(yōu)于四項單獨檢測。在評價AHSG和AFP聯合檢測，AHSG、AFP、AFU三者聯合檢測，AHSG、AFP、AEU、CEA四者聯合檢測的特異性和敏感度發(fā)現，腫瘤標記物數量增加過多時特異性和敏感度并無變化，因此在診斷原發(fā)性肝癌時并不是聯合檢測的項目越多，敏感度和特異性越高。然而本研究納入的原發(fā)性肝癌病例相對較少，缺乏隨訪數據，今后將大量收集隨訪的臨床數據，以更加明確AHSG對原發(fā)性肝癌的診斷意義。

綜上所述，AHSG在原發(fā)性肝癌診斷中是具有重要意義的腫瘤標志物之一，AHSG和AFP聯合檢測可彌補AFP單獨檢測的特異性不足問題，進一步提高了對原發(fā)性肝癌診斷的特異性。