周立琴，張新圓

1.新疆克拉瑪依市中心醫(yī)院婦科，新疆克拉瑪依 834000；2.烏魯木齊市第一人民醫(yī)院婦一科，新疆烏魯木齊 830011

子宮內(nèi)膜異位癥(EM)是育齡期女性多發(fā)疾病。異位內(nèi)膜侵襲周圍組織，容易形成異位結(jié)節(jié)，引發(fā)不孕、盆腔疼痛等癥狀，影響患者生活質(zhì)量。目前，臨床對(duì)于有生育需求的EM患者，多采用腹腔鏡保守性手術(shù)切除異位內(nèi)膜病灶，遏制疾病進(jìn)展[1]。但研究發(fā)現(xiàn)，腹腔鏡手術(shù)后約40%的EM患者可能會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)情況，增加二次手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，影響患者預(yù)后[2]。現(xiàn)階段臨床評(píng)估EM術(shù)后復(fù)發(fā)多依靠盆腔檢查、B超檢查等，此類檢查方式雖可明確病灶變化，但無(wú)法定量分析復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)用存在局限[3]。研究發(fā)現(xiàn)，EM的發(fā)生、發(fā)展與異位內(nèi)膜細(xì)胞黏附、新血管生成等密切相關(guān)[4]。半乳糖凝集素-3(Gal-3)是一種細(xì)胞凝集素，其可參與細(xì)胞黏附、炎癥反應(yīng)、新血管生成等多種生理過(guò)程，調(diào)控細(xì)胞遷移、增殖等[5]。環(huán)氧合酶-2(COX-2)作為前列腺素合成重要限速酶，在多種激素作用下可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞增殖，且可參與EM血管生成[6]。結(jié)合Gal-3、COX-2作用機(jī)制，推測(cè)二者可能與EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后有關(guān)，但具體關(guān)系尚未明確。鑒于此，本研究重點(diǎn)分析異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達(dá)水平與EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后的關(guān)系及其對(duì)患者手術(shù)治療預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究的開(kāi)展獲得新疆克拉瑪依市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選取2019年1月至2020年5月在新疆克拉瑪依市中心醫(yī)院擇期行腹腔鏡手術(shù)治療的107例EM患者作為研究對(duì)象，全部患者及家屬均知情同意并簽訂了知情同意書。收集患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、病程等一般資料。EM患者年齡23～44歲、平均(33.52±2.14)歲，平均BMI為(21.08±1.03)kg/m2，病程1～6年、平均(3.07±0.72)年。

1.2納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)EM診斷符合《子宮內(nèi)膜異位癥的診治指南》[7]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)異位病灶活檢確診；(2)具有腹腔鏡手術(shù)指征，且均為初次接受腹腔鏡保守性手術(shù)治療；(3)年齡≥18歲；(4)免疫系統(tǒng)、凝血功能正常；(5)精神正常，可配合研究；(6)均獲得隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌等惡性腫瘤患者；(2)病灶廣泛浸入周圍組織，與盆腔粘連或形成冷凍骨盆的患者；(3)病灶侵犯卵巢門部，影響卵巢血供的患者；(4)雙側(cè)卵巢巧克力囊腫最大徑≥15 cm患者；(5)合并心肝腎等重要臟器病變患者；(6)合并其他子宮疾病；(7)術(shù)前接受激素或其他相關(guān)治療患者；(8)合并炎癥性疾病患者；(9)哺乳或妊娠期患者。

1.3方法

1.3.1基線資料收集 設(shè)計(jì)基線資料填寫表，詢問(wèn)并記錄患者相關(guān)基線資料，包括：病變類型(膜腹型、卵巢型、深部浸潤(rùn)型)、不孕情況、r-AFS分期[8](Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期)、既往盆腔手術(shù)史等。

1.3.2儀器與試劑 高速離心機(jī)TGL-16.5M購(gòu)自濟(jì)南好來(lái)寶醫(yī)療器材有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析儀Lepgen-96購(gòu)自濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司；Trizol裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及相關(guān)試劑均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.3.3異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達(dá)水平檢測(cè) 取約200 mg異位病灶組織置于無(wú)菌試管內(nèi)，添加1 mL Trizol裂解液，劇烈振蕩后在室溫下靜置5 min，然后添加200 μL氯仿振蕩15 s，室溫下靜置10 min；在4 ℃環(huán)境下用高速離心機(jī)以12 000 r/min轉(zhuǎn)速、10 cm離心半徑離心15 min；取上層水相置于新的離心管，添加等體積異丙醇，混勻后，以同樣轉(zhuǎn)速、離心半徑離心15 min，棄層清液，添加75%乙醇，再次以同樣轉(zhuǎn)速、離心半徑離心5 min，棄上清液，在室溫下靜置10 min，最后添加20～60 μL ddH2O，完成樣本總RNA提??；用5×PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取樣本總cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系共10 μL，反應(yīng)條件：先95 ℃預(yù)變性3 min，然后依次94 ℃反應(yīng)15 s、55 ℃反應(yīng)15 s、72 ℃反應(yīng)30 s，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束將cDNA樣本置于-20 ℃環(huán)境下貯存；取cDNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)前先用RNase水將樣本稀釋20倍，反應(yīng)體系共2 510 μL，反應(yīng)條件：先95 ℃預(yù)變性3 min，然后依次95 ℃反應(yīng)5 s、60 ℃退火、延伸40 s，設(shè)定40個(gè)循環(huán)，最后用2-ΔΔCt法計(jì)算Gal-3、COX-2相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4隨訪 全部患者術(shù)后均接受1年隨訪，將隨訪期內(nèi)復(fù)發(fā)情況作為預(yù)后觀察指標(biāo)，復(fù)發(fā)患者納入預(yù)后不良組，未復(fù)發(fā)患者納入預(yù)后良好組。是否復(fù)發(fā)判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床體征，痛經(jīng)、月經(jīng)異常等癥狀消失后再次出現(xiàn)，或癥狀減輕后再次加重；(2)盆腔檢查，盆腔陽(yáng)性體征消失后再次出現(xiàn)，或陽(yáng)性體征緩解后再加重；(3)B超檢查，可見(jiàn)新的內(nèi)膜異位病灶。

2 結(jié) 果

2.1EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后情況 隨訪1年，107例EM患者中預(yù)后不良42例，占39.25%，預(yù)后良好65例，占60.75%。

2.2兩組基線資料及異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達(dá)水平比較 預(yù)后不良組r-AFS分期Ⅲ～Ⅳ期患者占比及異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達(dá)水平高于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組其他基線資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組基線資料及異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達(dá)水平比較

2.3EM患者異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達(dá)水平的相關(guān)性分析 Spearman雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示，EM患者異位內(nèi)膜組織中Gal-3表達(dá)水平與COX-2呈正相關(guān)(r=0.426，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 異位內(nèi)膜組織中Gal-3表達(dá)水平與COX-2間關(guān)系散點(diǎn)圖

2.4EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后影響因素的Logistic回歸模型分析 將2.2中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)r-AFS分期(1=Ⅲ～Ⅳ期，0=Ⅰ～Ⅱ期)、Gal-3、COX-2(均為連續(xù)變量)作為自變量，將EM患者腹腔手術(shù)治療預(yù)后情況作為因變量(1=預(yù)后不良，0=預(yù)后良好)，經(jīng)Logistic回歸模型分析結(jié)果顯示，r-AFS分期Ⅲ～Ⅳ期及Gal-3、COX-2表達(dá)水平升高可能是EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR>1，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后影響因素的Logistic回歸模型分析

2.5異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值 將Gal-3、COX-2作為檢驗(yàn)變量，將EM患者腹腔手術(shù)治療預(yù)后情況作為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的AUC分別為0.871、0.875、0.932，均>0.800，均有一定預(yù)測(cè)價(jià)值；當(dāng)二者cut-off值分別取1.950、3.460時(shí)，預(yù)測(cè)價(jià)值最佳。見(jiàn)表3。

表3 異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2預(yù)測(cè)EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值

圖2 異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線

3 討 論

EM病因復(fù)雜，多認(rèn)為與內(nèi)膜種植、免疫系統(tǒng)異常、炎癥等因素有關(guān)。據(jù)報(bào)道，EM發(fā)生率為10%～15%，且近年來(lái)發(fā)生率逐年升高[9]。腹腔鏡保守性手術(shù)作為EM常用術(shù)式，雖可有效切除異位病灶，保留患者生育功能，但術(shù)后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)情況，影響患者預(yù)后[10]。因此，明確可能與EM患者腹腔鏡手術(shù)復(fù)發(fā)有關(guān)指標(biāo)，對(duì)指導(dǎo)早期干預(yù)、改善患者預(yù)后有積極意義。

報(bào)道指出，重癥EM患者術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯高于輕癥患者，且隨著病情的加重，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加[11]。r-AFS分期是評(píng)估EM病情嚴(yán)重程度常用方式，其評(píng)估內(nèi)容主要包括病灶大小、粘連程度2個(gè)方面，可指導(dǎo)臨床選擇適宜治療方案[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，r-AFS分期Ⅲ～Ⅳ可能是EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR>1，P<0.05)，與董立娜等[13]研究結(jié)果一致。但r-AFS分期評(píng)估有一定主觀性，且無(wú)法預(yù)測(cè)患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)用存有一定局限。Gal-3是一種半乳糖結(jié)合蛋白，其主要表達(dá)于上皮細(xì)胞、纖維原細(xì)胞等，通過(guò)結(jié)合信號(hào)分子ras蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)等，可發(fā)揮促細(xì)胞增殖作用[14]。研究表明，Gal-3的C端CRD基序可結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等細(xì)胞表面特異性受體，促進(jìn)新血管生成，且可特異性結(jié)合細(xì)胞表糖蛋白，增強(qiáng)細(xì)胞黏附作用，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化[15]。此外，Gal-3還可參與輔助性T細(xì)胞2免疫應(yīng)答，影響免疫細(xì)胞對(duì)異位內(nèi)膜的清除能力，參與子宮內(nèi)膜疾病發(fā)生過(guò)程[16]。COX-2一種環(huán)氧合酶重要同工酶，其多被認(rèn)為是快速反應(yīng)基因，通常情況下組織活性低、表達(dá)量少，但當(dāng)細(xì)胞受炎癥、生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，COX-2會(huì)快速合成[17]。據(jù)報(bào)道，COX-2可參與炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子生成，從而加速細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖[18]。目前已有研究證實(shí)，COX-2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化過(guò)程，且可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲能力，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[19]。由于EM侵襲生物學(xué)行為與惡性腫瘤相似，吳敏等[20]研究觀察COX-2在EM中表達(dá)情況，結(jié)果顯示，EM患者內(nèi)膜組織中COX-2表達(dá)水平顯著高于在位內(nèi)膜及健康人，且r-AFS分期越高，COX-2表達(dá)水平越高。結(jié)合Gal-3、COX-2作用機(jī)制，推測(cè)二者可能與EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后有關(guān)。

為驗(yàn)證Gal-3、COX-2表達(dá)水平與EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后的關(guān)系，本研究證實(shí)了兩組異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)Spearman雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示，EM患者異位內(nèi)膜組織中Gal-3表達(dá)水平與COX-2呈正相關(guān)(r=0.426，P<0.001)，并經(jīng)Logistic回歸模型分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了Gal-3、COX-2表達(dá)水平可能是EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR>1，P<0.05)。分析原因在于，異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達(dá)水平升高，可能會(huì)促進(jìn)術(shù)后殘存內(nèi)膜組織新血管生成，加速內(nèi)膜組織增殖、分化，從而可能會(huì)增加內(nèi)膜組織再次異位風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，影響EM患者預(yù)后[21]。本研究最后繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)均有理想的價(jià)值，在二者cut-off值分別取1.950、3.460時(shí)，可獲得最佳預(yù)測(cè)價(jià)值，且隨著Gal-3、COX-2表達(dá)水平升高，患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，建議對(duì)異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達(dá)水平升高的EM患者，腹腔鏡手術(shù)后臨床應(yīng)早期予以孕激素類藥物干預(yù)，并囑咐患者盡早懷孕，預(yù)防疾病復(fù)發(fā)，改善患者預(yù)后。但本研究結(jié)果存在一定局限性，未來(lái)仍需積累更多樣本量展開(kāi)前瞻性研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后不良可能與異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2表達(dá)水平升高有關(guān)，且Gal-3、COX-2對(duì)EM患者腹腔鏡手術(shù)治療預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，未來(lái)可考慮檢測(cè)異位內(nèi)膜組織中Gal-3、COX-2水平，輔助評(píng)估EM患者術(shù)后預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)。