廖文超，錢 駿，王朋飛，方克寶

江油市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，四川綿陽 621700

因感染引發(fā)抗炎、促炎反應(yīng)調(diào)節(jié)失常的全身炎癥反應(yīng)綜合征稱為膿毒癥，隨著病情發(fā)展，可出現(xiàn)膿毒性休克、多器官功能衰竭，進(jìn)而危及膿毒癥患者生命健康[1]。有研究表明，全球每年膿毒癥患者約有1 900萬，且患病年齡段趨向于年輕化，增加了家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-3]。臨床對引起膿毒癥的各種細(xì)胞因子的研究結(jié)果表明，膿毒癥與多種細(xì)胞基質(zhì)異常密切相關(guān)，微小RNA-23b(miR-23b)作為新發(fā)現(xiàn)的微小RNA(miRNA)，能調(diào)控各種信號通路，刺激炎癥細(xì)胞分泌炎癥因子，進(jìn)而參與膿毒癥的發(fā)生、進(jìn)展[4-5]；微小RNA-146a(miR-146a)作為可影響機(jī)體免疫系統(tǒng)的miRNA，其主要調(diào)控內(nèi)毒素耐受機(jī)制，當(dāng)其分泌量增多時，可造成內(nèi)毒素過度表達(dá)，進(jìn)而加速膿毒癥病情發(fā)展[6]。吲哚胺-2，3-雙加氧酶(IDO)作為一種色氨酸代謝限速酶，主要由臟器淋巴、胸腺髓質(zhì)分泌，可使色氨酸水平下降，從而對T細(xì)胞增殖、凋亡造成影響[7-8]。國內(nèi)外對miR-146a、miR-23b、IDO在膿毒癥中表達(dá)的研究多為單一分析研究，聯(lián)合檢測這3項(xiàng)指標(biāo)在膿毒癥中的表達(dá)水平并分析其臨床價值的研究少見?；诖?，本文對這3項(xiàng)指標(biāo)在膿毒癥患者中的表達(dá)水平及臨床價值進(jìn)行研究，為膿毒癥的診斷、治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2019年1月本院重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)收治的105例膿毒癥患者作為膿毒癥組，另選擇本院同期103例體檢健康者作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有研究對象無其他免疫性疾病，無心臟疾病，具有生活自理能力；膿毒癥組符合《膿毒癥中西醫(yī)結(jié)合診治專家共識》[9]中的診斷準(zhǔn)則，體溫>38.3 ℃，心率90次/分，低血壓情況嚴(yán)重，伴有低氧血癥、急性少尿;對照組體檢指標(biāo)正常，無膿毒癥癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：處于瀕死狀態(tài)的患者；合并器官移植、惡性腫瘤的患者；具有酗酒、熬夜不良習(xí)慣的患者；近期使用激素治療的患者。膿毒癥組與對照組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、血液黏度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。按病情嚴(yán)重程度從輕到重將膿毒癥分為3種類型：膿毒癥為僅有全身炎癥反應(yīng)綜合征；嚴(yán)重膿毒癥為膿毒癥伴有其所致的器官功能障礙和(或)低血壓；膿毒性休克為感染引起的嚴(yán)重低血壓且補(bǔ)液效果差。膿毒癥組中有膿毒癥36例，嚴(yán)重膿毒癥34例，膿毒性休克35例。本研究獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有研究對象或其家屬均知曉本研究并簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料比較

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 采集對照組體檢當(dāng)天和膿毒癥組入院次日空腹靜脈血9 mL，以3 000 r/min離心12 min，收集血清，將血清置于5 ℃低溫箱中保存、待檢。

1.2.2miR-23b、miR-146a檢測 采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測兩組miR-23b、miR-146a水平，檢測方法：(1)總RNA提取。將保存的血清標(biāo)本使用Trizol試劑提取總RNA，并使用核酸蛋白檢測儀進(jìn)行濃度檢測。(2)cDNA合成。采用全式金公司TransScript?Ⅱ Reverse Transcriptas試劑盒方法，建立反應(yīng)體系，包括總RNA 5 μL、RT反應(yīng)緩沖液(10×)為2 μL、高質(zhì)量(HPLC級別)dNTPs 1 μL、MMLV 1 μL、隨機(jī)引物1 μL、補(bǔ)充無核酸酶水至20 μL。反應(yīng)條件為50 ℃，30 min。(3)qPCR。采用全式金公司TransStart?Green qPCR SuperMix試劑盒方法，建立反應(yīng)體系，包括cDNA模板2 μL、上下游引物各1 μL、SYBR Green qPCR mix 10 μL，補(bǔ)充無核酸酶水至20 μL。以U6為內(nèi)參，U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-CGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-23b上游引物為5′-GATGTGTATCCTCAGAGCTTTG-3′，下游引物為5′-CGATGACAGAGATATCCCAG-3′；miR-146a上游引物為5′-ACACTCCAGCTGGGATCACATTGCCAGG-3′，下游引物為5′-CTCAACTGGTGTGCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTA ATCC-3′。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 1 min，94 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45個循環(huán)，72 ℃終末延伸6 min。(4)建立熔解曲線。在94 ℃、反應(yīng)時間為60 s，接著在55～96 ℃，進(jìn)行熔解，緩慢提升溫度，每個反應(yīng)各溫度滯留35 s，重復(fù)45次，待反應(yīng)結(jié)束，用電腦繪制熔解曲線，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-23b、miR-146a的相對表達(dá)量。PCR儀器采用Gentier 96E全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)(西安天隆科技有限公司)。

1.2.3IDO檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測IDO，檢測方法：冰箱取出人IDO ELISA試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司)，置于室溫下30 min；據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)，每個標(biāo)準(zhǔn)品和血清標(biāo)本都做復(fù)孔。按照試劑盒說明書要求的比例稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL于標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)孔中，血清標(biāo)本和樣品稀釋液1∶1稀釋后加50 μL于樣品反應(yīng)孔中，每個反應(yīng)孔加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體，蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h。甩去孔內(nèi)液體，洗滌緩沖液清洗酶標(biāo)板孔3次。然后每孔加入50 μL的鏈霉親和素-辣根過氧化物酶，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育30 min。甩去孔內(nèi)液體洗滌緩沖液清洗酶標(biāo)板孔3次。每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育10 min。避免光照。取出酶標(biāo)板，每孔加入50 μL終止溶液，終止反應(yīng)；通過酶標(biāo)儀(Multiskan FC 酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司)在450 nm波長測定各孔的吸光度值。

1.2.4指標(biāo)觀察 統(tǒng)計(jì)所有研究對象的miR-23b、miR-146a、IDO水平。隨訪28 d時膿毒癥患者的預(yù)后情況，并根據(jù)預(yù)后情況將患者分為存活組和死亡組。比較膿毒癥組與對照組、不同病情嚴(yán)重程度和不同預(yù)后膿毒癥患者的miR-23b、miR-146a、IDO水平，分析miR-23b、miR-146a、IDO單獨(dú)和聯(lián)合檢測診斷膿毒癥的效能及這3項(xiàng)指標(biāo)間的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1膿毒癥組和對照組血清miR-23b、miR-146a、IDO水平比較 與對照組比較，膿毒癥組血清miR-146a、IDO水平升高，miR-23b水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 膿毒癥組和對照組血清miR-23b、miR-146a、IDO指標(biāo)比較

2.2不同病情嚴(yán)重程度膿毒癥患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平比較 不同病情嚴(yán)重程度膿毒癥患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而且隨著膿毒癥病情嚴(yán)重程度加重，miR-146a、IDO水平逐漸升高，miR-23b水平逐漸降低，見表3。

表3 不同病情嚴(yán)重程度膿毒癥患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平比較

2.3不同預(yù)后膿毒癥患者miR-23b、miR-146a、IDO水平比較 經(jīng)隨訪，28 d時膿毒癥患者死亡14例，存活91例。膿毒癥患者死亡組miR-146a、IDO水平高于存活組，miR-23b水平低于存活組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同預(yù)后膿毒癥患者miR-23b、miR-146a、IDO水平比較

2.4血清miR-23b、miR-146a、IDO水平間的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-23b水平與miR-146a、IDO均呈線性負(fù)相關(guān)(r=-0.618、-0.623，P<0.001)，miR-146a水平與IDO呈線性正相關(guān)(r=0.552，P<0.001)，見圖1。

注：A為miR-23b水平與miR-146a間關(guān)系散點(diǎn)圖；B為IDO水平與miR-23b間關(guān)系散點(diǎn)圖；C為miR-146a水平與IDO間關(guān)系散點(diǎn)圖。

2.5血清miR-23b、miR-146a、IDO單獨(dú)和聯(lián)合檢測對膿毒癥的診斷效能 ROC曲線分析顯示，血清miR-23b、miR-146a、IDO聯(lián)合檢測診斷膿毒癥的曲線下面積(AUC)為0.846，高于miR-23b、miR-146a、IDO單項(xiàng)檢測診斷膿毒癥的0.796、0.808、0.734，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)約登指數(shù)最大時，miR-23b、miR-146a、IDO對應(yīng)的最佳臨界值分別為1.68、2.98、17.35 ng/L。見表5。

表5 血清miR-23b、miR-146a、IDO單獨(dú)和聯(lián)合檢測診斷膿毒癥的效能

3 討 論

膿毒癥是因感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，可造成急性多器官功能障礙或在膿毒癥的基礎(chǔ)上出現(xiàn)補(bǔ)液難以糾正的低血壓等癥狀，其發(fā)生的主要原因是嚴(yán)重?zé)齻?、?chuàng)傷、外科大手術(shù)后感染、缺血再灌注損傷等[10]。miR-23b是具有調(diào)節(jié)作用的miRNA，其具有調(diào)控基因表達(dá)及健康穩(wěn)態(tài)細(xì)胞促氧化、抗氧化的能力，其分泌量下降會增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞黏，造成患者病情進(jìn)一步惡化[11]。miR-146a可刺激白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6表達(dá)水平上升，加劇炎癥反應(yīng)，影響患者病情恢復(fù)[12]。IDO使色氨酸水平下降，進(jìn)而對T細(xì)胞的增殖、凋亡及活性造成損害，并影響膿毒癥治療結(jié)局[13]。本研究檢測ICU膿毒癥患者血清miR-23b、miR-146a、IDO水平，為膿毒癥診斷、治療提供參考依據(jù)。

miRNA作為內(nèi)源性短鏈非編碼RNA，可與特異性RNA靶向結(jié)合，發(fā)揮降解、抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯功能的作用[14]。有研究表明，miR-23b通過激活TAB2蛋白活性，在自身免疫缺陷疾病中發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)作用，并可影響炎癥細(xì)胞分泌炎癥物質(zhì)，最終對免疫性疾病、膿毒癥達(dá)到治療目的[15]。本研究表明，膿毒癥組血清miR-23b水平低于對照組(P<0.05)，并隨著膿毒癥病情嚴(yán)重程度的加重而降低，且死亡組血清miR-23b水平低于存活組(P<0.05)。miR-23b具有減輕炎癥反應(yīng)的作用，其水平升高會抑制細(xì)胞應(yīng)激，促進(jìn)炎癥細(xì)胞凋亡，并靶向調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β活性激酶，阻斷相關(guān)信號通路，從而降低膿毒癥炎癥因子水平，結(jié)果顯示，miR-23b通過降低炎癥細(xì)胞增殖、分化能力及增強(qiáng)炎癥細(xì)胞凋亡能力，從而使患者癥狀減輕，其可作為膿毒癥臨床診斷及預(yù)后判斷的指標(biāo)[16-17]。

miR-146a通過與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6、白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶-1的作用，正性調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的信號通路，從而增強(qiáng)炎癥細(xì)胞遷移、侵襲能力，加快炎癥因子的分泌[18-19]。本研究顯示，膿毒癥組血清miR-146a水平較對照組升高(P<0.05)，并隨膿毒癥病情嚴(yán)重程度的加重而升高，且死亡組miR-146a水平高于存活組(P<0.05)。miR-146a通過刺激多種信號通路靶點(diǎn)，如CC類趨化因子5、Fas相關(guān)死亡域蛋白、白細(xì)胞介素-8等，加速免疫細(xì)胞凋亡，抑制免疫細(xì)胞分化過程，負(fù)反饋調(diào)控免疫反應(yīng)，控制內(nèi)毒素分泌，加速膿毒癥惡化，加重了機(jī)體的損害，結(jié)果顯示，miR-146a通過增強(qiáng)膿毒癥患者的炎癥反應(yīng)而對機(jī)體產(chǎn)生作用，其具有較高的靈敏度和特異度，可作為早期判斷膿毒癥患者預(yù)后的指標(biāo)，并為臨床治療膿毒癥提供指導(dǎo)[20-21]。

IDO是除肝臟外唯一存在的可催化L-色氨酸分子中吲哚環(huán)裂解并犬尿酸途徑降解的限速酶[22]。有研究表明，IDO利用色氨酸使T細(xì)胞增殖停止，分化受阻，并對T細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，抑制T細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)其凋亡，降低活化T細(xì)胞的免疫功能，從而參與膿毒癥的病情發(fā)展[23]。本研究顯示，膿毒癥組IDO水平高于對照組(P<0.05)，并隨著膿毒癥病情嚴(yán)重程度的加重而升高，且死亡組IDO水平高于存活組(P<0.05)。由此可見，IDO通過影響膿毒癥患者機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而加劇炎癥反應(yīng)，其可作為膿毒癥預(yù)后判斷的相關(guān)因子，為膿毒癥患者轉(zhuǎn)歸提供理論參考。

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，miR-23b水平與miR-146a、IDO均呈線性負(fù)相關(guān)(r=-0.618、-0.623，P<0.001)，miR-146a水平與IDO呈線性正相關(guān)(r=0.552，P<0.001)；進(jìn)一步采用ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-23b、miR-146a、IDO單獨(dú)檢測對膿毒癥的診斷均有一定的價值(AUC均大于0.700)，而且這3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測診斷膿毒癥的價值更高。本研究尚存在不足，如雖然揭示了miR-23b、miR-146a、IDO緊密聯(lián)系，但未深入判斷三者相互反應(yīng)機(jī)制，需要擴(kuò)大樣本量，繼續(xù)對這3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行研究。

綜上所述，膿毒癥患者血清miR-146a、IDO水平升高，miR-23b水平降低，這3項(xiàng)指標(biāo)密切相關(guān)，可為膿毒癥的診斷、病情嚴(yán)重程度和預(yù)后判斷提供新的參考依據(jù)。