譚麗，王成，陳世玖

(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院整形手外科,廣東 珠海 519100)

血管參與構(gòu)成人體循環(huán)系統(tǒng)，作為眾多組織、器官運輸能量的載體，起到再植后向組織、器官供送血液的作用，血管超低溫保存技術(shù)可增加器官、斷肢、斷指移植機會。在實驗和臨床工作的基礎(chǔ)上，2011—2013年首次驗證了深低溫保存的動靜脈移植物用于臨床[1]。人體血管超低溫保存技術(shù)是旁路手術(shù)或外周血管重建的重要工具，因此需儲備大量血管供臨床所需[2]。最初研究冷凍保存的方法主要為細胞深低溫保存技術(shù)，對于同種細胞類型，存在一組最佳保存的條件；而組織是復(fù)雜的多細胞系統(tǒng)，其含有不同類型的細胞，具有不同的超低溫保存要求。在冷凍保存過程中，組織內(nèi)的所有細胞類型將受到相同的冷卻和解凍參數(shù)，并且組織的結(jié)構(gòu)及功能更為復(fù)雜，故確保血管結(jié)構(gòu)的完整和功能的保留是決定超低溫保存成功的關(guān)鍵[3]。理想的超低溫保存血管應(yīng)保持與新鮮血管相當(dāng)?shù)墓δ芴匦?，超低溫保存技術(shù)是最常見的保存方法，在超低溫保存中會引起細胞凋亡及組織結(jié)構(gòu)損害，為了改善冷凍和解凍過程中的細胞損傷，冷凍保護劑(cryoprotectant，CPA)在超低溫保存中被應(yīng)用[4]。但常見CPA具有一定的毒性作用，阻礙超低溫保存同種異體血管的臨床發(fā)展[5]?，F(xiàn)通過血管超低溫保存的損傷機制、CPA在血管超低溫保存中的應(yīng)用及對血管超低溫保存技術(shù)的展望總結(jié)當(dāng)前血管超低溫保存技術(shù)的現(xiàn)況，為后續(xù)制訂更標準的血管及器官超低溫保存方案提供一定的理論依據(jù)。

1 血管超低溫保存的損傷機制

19世紀和20世紀早期，生物學(xué)家對冬季耐寒和冰霜抵抗研究后產(chǎn)生了一些最早的冷凍保存概念，在沒有添加任何CPA的生物樣品中，凍結(jié)的細胞和組織發(fā)生了深低溫保存誘發(fā)的損傷，例如細胞內(nèi)冰晶形成和巨大滲透差。血管由內(nèi)膜層、中膜層、外膜層組成，三層膜分界不清，內(nèi)膜層由血管內(nèi)皮細胞組成，向外延續(xù)至肌層，中膜層由平滑肌細胞及纖維細胞構(gòu)成，向外延續(xù)至漿膜層。血管是由多種細胞及纖維組織、基膜構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，超低溫保存均會造成這兩種結(jié)構(gòu)的損傷。

1.1血管細胞損傷 構(gòu)成血管組織的細胞包括內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、纖維細胞等，在超低溫保存過程中隨著冷卻的進行，細胞在超低溫保存液中失去滲透平衡。從常溫至-196 ℃，細胞及細胞外基質(zhì)發(fā)生一系列變化；在冷卻溫度 -5 ℃時，細胞外基質(zhì)開始冷凍，但細胞質(zhì)仍未凍結(jié)；在-5～-10 ℃，細胞外冰晶形成增多導(dǎo)致基質(zhì)中溶質(zhì)濃度增加，造成嚴重細胞脫水和收縮；在-10～-15 ℃，細胞外冰晶形成進一步增多，細胞與冰和細胞與細胞接觸增加，導(dǎo)致細胞損傷。事實上，在-15～-60 ℃，細胞內(nèi)液完成水到冰的過渡，細胞內(nèi)凍結(jié)增多；細胞外冰晶生長較大，冰晶氫鍵通過細胞膜實現(xiàn)細胞內(nèi)凍結(jié)，以此來均衡細胞內(nèi)外滲透壓。細胞內(nèi)凍結(jié)被認為是冷凍保存誘導(dǎo)的細胞損傷的主要因素[6]。因此，在-15～-60 ℃，必須實現(xiàn)兩次冷凍、解凍，這是細胞成活的重大挑戰(zhàn)[7]。

1.2血管細胞外成分損傷 血管組織除了由各類細胞構(gòu)成外還有纖維組織、基膜等。血管屬圓筒狀結(jié)構(gòu)，在超低溫保存過程中體積膨脹和組織內(nèi)溫度分布不均引起生物樣品內(nèi)部溫度分布不均，溫差較大，在組織內(nèi)部產(chǎn)生較大的熱應(yīng)力，尤其是在凍結(jié)過程中由于體積膨脹引起的熱應(yīng)力，使超低溫保存的組織遭受機械損傷。1994年Hunt等[8]發(fā)現(xiàn)血管超低溫保存中組織的斷裂，徐紅艷等[9]發(fā)現(xiàn)，低溫保存血管組織時,管壁上出現(xiàn)裂紋甚至發(fā)生斷裂，并提出其與降溫速率有關(guān)。采用階梯式慢速復(fù)溫可以減少血管超低溫保存中的機械應(yīng)力損傷。此外，在超低溫保存中加入CPA使得血管凍結(jié)過程未凍結(jié)水分額明顯增大，避免了熱應(yīng)力對血管的機械損傷。胥義等[10]的實驗亦證明，降溫速率和低溫保護劑濃度會對血管熱應(yīng)力產(chǎn)生影響。添加高濃度的CPA時，血管超低溫保存中的熱應(yīng)力顯著減小。

2 CPA在血管超低溫保存中的應(yīng)用

為避免超低溫保存中細胞內(nèi)外冰晶形成及凍結(jié)后的機械應(yīng)力損傷，研究人員開始向超低溫保存液中添加化學(xué)品，它們被稱為“CPA”，并進行了CPA的初步嘗試。CPA是一種廣泛的術(shù)語，可以用于描述任何外部添加劑，當(dāng)在冷凍之前添加時，可保護細胞免受各種超低溫保存損傷并保留細胞活力。根據(jù)能否通過細胞膜將CPA分為滲透性和非滲透性，常見的滲透性CPA有二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、甘油、甲酰胺和丙二醇等；非滲透性CPA有糖類(如蔗糖、海藻糖、葡聚糖、乳糖和D-甘露醇)和高分子聚合物類[如聚乙二醇和羥乙基淀粉(hetastarch,HES)]。它們的冷凍保護作用包括降低溶質(zhì)的濃度以及在脫水和復(fù)溫階段增加膜穩(wěn)定性[11]。在超低溫保存中使用低濃度CPA以保護血管同種異體移植物為經(jīng)典的超低溫保存方式——超低溫慢速冷凍技術(shù)；雖然低濃度CPA可以減少冰晶的形成，但不能形成玻璃化狀態(tài)。然而，玻璃化形成需要較高濃度的CPA，常用的CPA(如DSMO)具有一定的毒性，故冷凍保護溶液的毒性去除需要更多的研究，為超低溫保存組織庫制訂更為標準的玻璃化保存方案[12]。

2.1滲透性CPA的應(yīng)用 1949年，由于錯誤標記凍結(jié)了甘油、雞蛋液及水，發(fā)現(xiàn)甘油具有冷凍保護的作用[13]；隨后其被廣泛應(yīng)用于細胞與組織超低溫保存。早在1976年，Ramazzotto和Engstrom[14]將灌注5%、10%及15%甘油哺乳動物心臟放入液氮中進行超低溫保存，并且用組織學(xué)、組織化學(xué)和電子顯微鏡技術(shù)檢查心室組織的組織學(xué)損傷、糖原耗竭和酶位點，發(fā)現(xiàn)甘油在心臟深低溫保存中具有保護作用。有報道顯示，使用血管吻合術(shù)移植超低溫保存的大鼠卵巢中可產(chǎn)生正常卵子，并發(fā)現(xiàn)在冷凍大鼠卵巢中有一部分血管功能保存良好[15]。甘油由于具有脂溶性可進入細胞內(nèi)，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外滲透壓，從而減輕血管在超低溫保存中的損傷。

甘油的運用雖廣泛，但不能溶于水，不能用作保存所有細胞類型的通用溶質(zhì)。為了克服這一問題，Lovelock[16]開始探索其他低分子量的化合物，發(fā)現(xiàn)DMSO對活細胞的滲透性比甘油更高，觀察到DMSO滲透細胞(牛和人紅細胞)的速度比甘油更快，且需要量低，凍結(jié)損傷小。1987年，O′Brien等[17]引入了使用DMSO作為CPA的心血管組織的長期儲存的冷凍保存，并證實了DMSO對主動脈的保護效果，新鮮與冷凍保存的同種異體移植物的活力相近。Westphal等[18]用DMSO灌注和浸泡動物卵巢進行超低溫保存，發(fā)現(xiàn)低溫保護水平可達90%～100%，當(dāng)使用相同的方法超低溫保存人類卵巢時，在組織水平上觀察到其保護作用超過95%；此外，血管內(nèi)皮沒有明顯的形態(tài)學(xué)損傷。

2.1.1滲透性CPA的毒性 2018年，F(xiàn)inger和Bischof[19]提出玻璃化保存是器官超低溫保存的一個新技術(shù)，可以替代常規(guī)超低溫保存。玻璃化保存是通過調(diào)節(jié)CPA濃度和冷卻速率，使液體物質(zhì)快速冷卻的過程，其過程基本上可以預(yù)防細胞內(nèi)外冰晶形成，將冷卻的液體轉(zhuǎn)化為玻璃化狀態(tài)，更好地保存細胞外基質(zhì)和細胞活力。玻璃化保存技術(shù)需高濃度的CPA，故CPA的毒性作用被關(guān)注。作為最廣泛使用的CPA，DMSO本身具有的劣勢限制了其臨床應(yīng)用。首先，DMSO是具有內(nèi)在毒性的有機溶劑。據(jù)報道，DMSO與細胞代謝和發(fā)育的功能障礙有關(guān)，引起酶的功能受損和細胞凋亡[20]；此外，DMSO可強烈促進干細胞不受控制的分化[21]。在臨床細胞移植中，DMSO被認為是引起患者各種不良反應(yīng)的原因，包括免疫、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥和腎肝功能的影響等[22]。其次，為了使DMSO引起的不利影響最小化，需要較長時間的洗滌步驟，因為DMSO的跨膜擴散速率明顯低于水通道蛋白的運輸速率，在DMSO去除期間，巨大滲透壓差也會導(dǎo)致細胞損傷。故如何降低超低溫保存中CPA的毒性有待進一步研究。

2.1.2低毒滲透性CPA DMSO具有一定毒性作用，難以應(yīng)用于臨床，因此需要更為標準的CPA來替代DMSO，天然生物相容性滲透性CPA同樣可以通過降低滲透壓來保護細胞，防止細胞免受滲透損傷的影響，而不會影響重要的細胞功能。此外，大多數(shù)滲透劑是親水分子，脯氨酸、甘氨酸和牛磺酸是3種類型生物相容性滲透性CPA的代表[23]，天然存在于哺乳動物的組織、肌肉和心臟中。Yang 等[24]探討了3種生物相容性滲透性CPA的作用，發(fā)現(xiàn)脯氨酸預(yù)防哺乳動物細胞滲透損傷及抑制細胞內(nèi)外冰晶形成的能力較強。為尋找高效和生物相容性的CPA提供了一種新途徑。

2.2非滲透性CPA的應(yīng)用 一些糖類(蔗糖，海藻糖和棉籽糖)以及高分子聚合物類(HES)已用于哺乳動物組織的玻璃化保存[25]。糖類在超低溫保存中的作用為：①增加玻璃化溶液的黏度，并提高玻璃化溶液所需的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，減少細胞外冰晶形成導(dǎo)致的細胞物理損傷[26]；②在冷凍期間通過氫鍵穩(wěn)定細胞膜，從而保護細胞[27]；③在冷卻過程中，糖類保護組織和細胞免受降溫和CPA去除期間的滲透沖擊引起的損傷；在變暖期間，細胞外CPA濃度迅速降低，導(dǎo)致滲透性不均衡引起細胞過度膨脹，最終導(dǎo)致細胞裂解[28]；④輔助滲透CPA形成玻璃化，糖類有助于增加玻璃化溶質(zhì)的黏度和張力，允許使用較低濃度的滲透CPA，從而降低滲透性CPA的細胞毒性和滲透休克效應(yīng)[28]；⑤糖類還可以幫助滲透性CPA提高細胞外溶液的玻璃化狀態(tài)，大大減少細胞外冰晶的形成。

2.2.1糖類 非滲透性CPA通過在低溫下保留更多的液態(tài)水來穩(wěn)定細胞體積，從而降低外部電解質(zhì)濃度，減少滲透損傷，如單糖和二糖均廣泛用于細胞系的低溫保存。但與單糖相比，蔗糖和海藻糖是所有二糖中最有效的CPA。在血管超低溫保存中，糖類常作為輔助保護劑與滲透性CPA一起發(fā)揮保護作用。1992年，Müller-Schweinitzer 和Ellis[29]將蔗糖和DMSO一起用于超低溫保存血管并探索其功能活性，證實了滲透和非滲透性的保護作用是協(xié)同的，即通過DMSO和蔗糖的組合作用，可實現(xiàn)對冷凍血管平滑肌的保護。在糖類中，因為蔗糖成本低，所以主要用于哺乳動物組織的玻璃化。Arutyunyan等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，最終濃度為0.2 mol/L蔗糖會提高甘油的效率；10%甘油和蔗糖的組合保存效果與DMSO和乙二醇與蔗糖的組合相當(dāng)，故蔗糖對脂膜的動態(tài)特性會促進甘油進入細胞。滲透性和非滲透性CPA均直接在細胞膜水平上發(fā)揮作用，所以它們的保護行為是協(xié)同作用。

此外，研究表明中藥及復(fù)方可以改善血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷，一些中藥提取物值得被關(guān)注，如枸杞多糖、附子多糖等；這些中藥提取物作為非滲透性CPA具有低毒性的特點，顏貝等[31]將枸杞多糖應(yīng)用于精子的超低溫保存保護，發(fā)現(xiàn)其可降低精子活性氧水平，保護線粒體結(jié)構(gòu)和功能，從而改善解凍后精子質(zhì)量。附子多糖是我國中藥附子中的提取物，其可以抑制血管鈣化、延緩心肌衰老及保護心肌細胞等。研究發(fā)現(xiàn)，附子多糖具有抗氧化應(yīng)激、保護平滑肌細胞及內(nèi)皮細胞的功能，從而保護血管[32]，由此可將附子多糖引入血管的深低溫保護研究中，但目前尚缺乏整體且系統(tǒng)的實驗研究。

2.2.2高分子聚合物類 一些高分子聚合物也被用于血管冷凍保護，如HES，K?rber和Scheiwe[33]的研究表明,HES通過從細胞膜外部吸收水分子并將它們保持在玻璃化狀態(tài)下，而不會在冷卻期間降低超低溫保存液的黏度，引發(fā)脫水速率的增加(避免細胞內(nèi)冰晶形成以及冷卻損傷)，動力學(xué)抑制冰晶形成。迄今為止，HES已成功用于冷凍保存許多生物材料，包括胰島、肉芽細胞、倉鼠細胞和其他一些細胞類型[34]。非滲透性CPA具有低毒性的特點，但單獨使用保護效果欠佳，聯(lián)合使用滲透性和非滲透性CPA可以減輕毒性，同時實現(xiàn)更強的血管內(nèi)皮細胞保護作用。Sultani等[35]通過將DMSO與HES聯(lián)用改善了超低溫保存后人臍靜脈內(nèi)皮細胞的活力。

2.3新型CPA——間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC) 除多種CPA聯(lián)合應(yīng)用外，MSC在組織再生中發(fā)揮重要作用并被廣泛研究[36]，如傷口修復(fù)、維持組織穩(wěn)態(tài)和促血管化。在適當(dāng)?shù)臈l件下，MSC可以被激活，獲得內(nèi)皮表型，分化為周細胞或內(nèi)皮細胞，并摻入血管壁中，該血管壁支持新血管形成和穩(wěn)定原有血管。此外，MSC能夠分泌各種血管生成因子，例如血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素、成纖維細胞生長因子和白細胞介素-6，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞募集以建立血管形成的微環(huán)境[37]，這些因素均有利于血管生成。Xia等[38]在小鼠卵巢超低溫保存中加入MSC發(fā)現(xiàn)，其可以促進卵巢血管的生成。MSC可作為新型CPA與滲透性和非滲透性CPA一起發(fā)揮保護作用，這一研究為探索CPA的種類提供了新思路。

3 小 結(jié)

玻璃化保存是血管超低溫保存的首選技術(shù)，為使超低溫保存液達到玻璃化狀態(tài)需要添加高濃度的CPA。常見CPA中的DMSO具有較大的毒性作用，故低毒性的CPA(如多糖類)及無毒性的CPA為研究熱點。針對不同的部位及種類血管組織，如何選擇合適的CPA并靶向制訂超低溫保存方案，既確保血管超低溫保存后具有生物活性，降低免疫原性，又能抑制血栓形成，有待進一步研究。期待在未來，通過技術(shù)的革新，對血管及其他器官制訂出一套完整的靶向超低溫保存方案，并成立“血管銀行”甚至“器官銀行”，為臨床應(yīng)用及科研發(fā)展提供更多的便利。