劉曉梅，蘇文英，紀 偉，王光飛，郭德杰，馬 艷，任立凱*

（1.連云港市農(nóng)業(yè)科學院，江蘇 連云港 222000；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 資源與環(huán)境研究所,江蘇 南京 210014）

隨著我國農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，設(shè)施蔬菜的種植面積逐年增加，并在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著重要地位。然而，在種植過程中，農(nóng)戶為了追求高產(chǎn)，農(nóng)藥和化肥的不合理使用導致土壤酸化、次生鹽漬化、土傳病害、水環(huán)境污染等問題日漸突出［1-2］。蘇北設(shè)施蔬菜以產(chǎn)值高的茄果類蔬菜為主，其種植面積占江蘇65%以上［3］。茄果類蔬菜因采收期長、產(chǎn)量大，盲目、過量施用畜禽類農(nóng)家肥和化肥的現(xiàn)象更為突出，導致土壤養(yǎng)分過剩、理化性狀惡化、整體質(zhì)量下降［4］。設(shè)施蔬菜土壤質(zhì)量的退化和生態(tài)環(huán)境的惡化不僅影響了蔬菜的生長，造成減產(chǎn)減收，而且嚴重威脅到食品安全和人類健康。因此，在設(shè)施蔬菜種植過程中，如何均衡合理配施有機無機肥料已成為當前研究的熱點。大量研究表明，均衡合理配施有機無機肥料，不僅有利于促進土壤碳、氮轉(zhuǎn)化、提升土壤肥力可持續(xù)性，而且能夠提高和改善作物的產(chǎn)量與品質(zhì)，減少作物發(fā)病率，改善土壤理化性狀，增加土壤微生物多樣性等［5-10］。

據(jù)統(tǒng)計，我國中藥渣的年排放量達6000萬～7000萬t［11］。中藥渣作為一種有機廢棄物目前尚無大規(guī)模利用的有效途徑，一般是作為廢棄物，多采用簡單粗放的手段堆放、填埋或焚燒處理，不僅造成了資源浪費，也極易對周圍環(huán)境造成污染［12-13］。中藥渣營養(yǎng)成分豐富，富含纖維、多糖、蛋白以及微量元素等營養(yǎng)成分，重金屬含量低且不含病原菌和抗生素，質(zhì)輕、通氣性好，是一種優(yōu)質(zhì)的有機肥原料［14-15］，將中藥渣發(fā)酵成為有機肥，應(yīng)用到農(nóng)業(yè)栽培中進行改土培肥是實現(xiàn)中藥渣資源化利用的有效方式之一［16-19］。

土壤微生物作為土壤生態(tài)鏈中的關(guān)鍵組成部分，直接參與土壤結(jié)構(gòu)的形成，推動著土壤養(yǎng)分的循環(huán)和能量流動，在維持土壤生態(tài)功能中扮演著重要角色［20］，其中細菌在土壤微生物數(shù)量中占有絕對優(yōu)勢，決定著土壤微生物總量的分布，影響著有機物的分解和轉(zhuǎn)化［21］。設(shè)施蔬菜種植過程中土壤微生物多樣性、群落組成和結(jié)構(gòu)的變化可以作為土壤受損程度和質(zhì)量變化的重要預(yù)警指標，理解土壤微生物及功能群的變化對揭示設(shè)施蔬菜栽培條件引起的土壤質(zhì)量退化微生物學機制及保持設(shè)施土壤可持續(xù)性具有重要意義。

目前，對于中藥渣有機肥的應(yīng)用研究主要在于提高作物產(chǎn)量和改善品質(zhì)等方面［22-23］。本試驗探究了中藥渣有機肥在與不同用量化肥的協(xié)同作用下，設(shè)施番茄的生長狀況，并利用高通量測序技術(shù)，分析不同處理下土壤微生物多樣性、群落組成和結(jié)構(gòu)的差異，并揭示影響作物生長的關(guān)鍵土壤環(huán)境因素，闡明土壤微生物群落對設(shè)施生產(chǎn)條件變化的響應(yīng)規(guī)律，為中藥渣有機肥與化肥的科學合理化配施提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況和供試材料

試驗在江蘇省連云港市農(nóng)業(yè)科學院東辛試驗基地塑料大棚中進行。供試土壤基本理化性狀為：pH值7.8、有機質(zhì)含量22.32 g/kg、全氮2.0 g/kg、全磷1.7 g/kg、全鉀15.7 g/kg。供試作物番茄為粉果，由淮安市農(nóng)業(yè)科學研究院提供。供試化肥為金正大復合肥（15-15-15）、硫酸鉀（K2O ≥52%）、磷酸二銨（N 18%、P2O546%）。中藥渣有機肥由江蘇好徠斯肥業(yè)有限公司提供，中藥渣有機肥含有機質(zhì)≥45%、N 1.78%、P2O50.92%、K2O 2.63%、水分含量40%。含微量元素的高鉀水溶肥（順欣15-15-30-TE）。

1.2 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)4個處理。CMR60處理組施用3500 kg/667 m2中藥渣有機肥+60 kg/667 m2NPK化肥、CMR70處理組施用3500 kg/667 m2中藥渣有機肥+70 kg/667 m2NPK化肥、CMR80處理組施用3500 kg/667 m2中藥渣有機肥+80 kg/667 m2NPK化肥、CMR90處理組施用3500 kg/667 m2中藥渣有機肥+90 kg/667 m2NPK化肥，各處理肥料施用量見表1。每個處理4次重復，共16個小區(qū)，每小區(qū)面積為12.6 m2，每個小區(qū)種植3壟，每壟2行，每行8棵（行間距35 cm，株距30 cm），完全隨機區(qū)組設(shè)計。中藥渣有機肥作為基肥一次性施入，化肥基追肥的比例為1∶1.6。4月26日左右移栽，坐果后，每隔10～12 d沖施10 kg/667 m2高鉀水溶肥（15-15-30-TE），整個生長期共追肥7次，各處理用量一致。

表1 不同處理中藥渣有機肥和化肥的用量 kg/667 m2

1.3 土壤樣品的采集與分析

土壤樣品采集時間為2019年7月19日，用環(huán)刀取0～10 cm土層土壤樣品測定其物理性質(zhì)。另外，采集各處理耕層（0～20 cm）土壤樣品，每小區(qū)多點混合采樣，去除植物根系和石塊，采用四分法分為2份：1份自然風干過篩用于測定土壤化學性質(zhì)；1份裝入無菌袋中帶回實驗室，-80 ℃冰箱保存用于微生物DNA的提取，各處理編號與采集土樣編號一致。

1.4 番茄各項指標的測定

番茄植株生長指標、產(chǎn)量及品質(zhì)的測定：定植后每隔30 d測定植株的株高、莖粗、葉綠素，共測定4次。于采收期測定植株產(chǎn)量，并測定果實的可溶性固形物和可滴定酸的含量。株高是番茄植株子葉到生長點的高度，用卷尺測量；莖粗是生長點以下第6～7片真葉間的莖的直徑（移栽后第1次測量子葉與第1片真葉間的莖的直徑）；葉綠素采用葉綠素測定儀測量；可溶性固形物采用手持糖度計測定；可滴定酸采用酸堿滴定法測定。

土壤理化性質(zhì)測定：土壤pH值采用pH計測定（土水比1∶2.5）；有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀滴定法測定；全氮（TON）采用凱氏定氮儀進行測定；全磷含量采用鉬銻抗比色法測定；全鉀采用火焰光度法測定［24］；土壤細菌群落分析由上海派森諾生物科技股份有限公司（上海）完成，采用Illumina MiSeq平臺對細菌群落DNA片段進行雙端（Paired-end）測序。

1.5 統(tǒng)計分析方法

采用QIIME進行土壤細菌群落相關(guān)指標分析；采用Excel 2012軟件制圖；采用SAS 9.0軟件對番茄各農(nóng)藝性狀及土壤基本屬性進行顯著性分析；采用歐易生物云對土壤菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子進行冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

從表2可以看出，不同施肥處理后土壤有機質(zhì)含量存在顯著差異，含量由高到低依次是CMR80＞CMR90＞CMR60＞CMR70。CMR80處理組的土壤全氮含量最高，其次是CMR60處理組，均顯著高于CMR70、CMR90處理組。CMR80處理組的土壤全磷含量顯著低于其他處理組，且其他處理組之間無顯著差異；CMR80處理組土壤全鉀含量顯著低于CMR90處理組，其他處理組之間無顯著差異。各處理組土壤pH值無顯著差異。

表2 中藥渣有機肥配施化肥處理后土壤基本性質(zhì)

2.2 番茄植株生長指標及產(chǎn)量、品質(zhì)

從圖1可以看出，隨著生長時間的延長，番茄的株高和葉綠素含量逐漸增加，莖粗先升高后降低，在5月26日、6月25日測量值相對較高，各處理的株高、莖粗、葉綠素含量無顯著差異，僅在5月26日，CMR80處理組番茄葉片的葉綠素含量顯著低于CMR70、CMR90處理組，與CMR60處理組無顯著差異，在7月25日，CMR70、CMR90處理組番茄株高顯著高于CMR60、CMR80處理組，且兩者之間無顯著差異。

圖1 中藥渣有機肥配施化肥對番茄株高、莖粗、葉片葉綠素含量的影響

由表3可知，各處理組的產(chǎn)量無顯著差異，其中CMR70處理組產(chǎn)量最高。CMR60、CMR80處理組番茄的可溶性固形物含量最高，顯著高于其他處理組，但兩者之間無顯著差異，其中CMR90處理組番茄可溶性固形物最低。CMR70、CMR90處理組番茄可滴定酸含量最低，顯著低于CMR60處理組，但兩者之間，以及它們與CMR80處理組均無顯著差異。

表3 中藥渣有機肥配施化肥對番茄產(chǎn)量及果實品質(zhì)的影響

2.3 土壤測序結(jié)果與OTU特性分析

基于16 S rRNA的高通量測序，共獲得1892279個有效序列，其中，CMR60、CMR70、CMR80、CMR90處理組樣品的平均有效序列數(shù)分別為125523±5769、116546±5312、122016±8927、108985±9645。對每組樣品隨機抽取91276條序列進行抽平，在0.95相似水平下進行聚類，得到每組樣本OTU數(shù)（圖2）。CMR60處理組樣品中細菌群落OTU數(shù)是13531，CMR60處理組樣品中細菌群落OTU數(shù)是13190，CMR60處理組樣品中細菌群落OTU數(shù)是13382，CMR60處理組樣品中細菌群落OTU數(shù)是11568。各處理共同的OTU數(shù)為3932（圖2），特有的OTU數(shù)相對較少，CMR60、CMR70、CMR80、CMR90分別為4966、4871、3938、4865。

圖2 土壤樣品中微生物群落OTU維恩圖

2.4 土壤微生物多樣性分析

土壤樣品的Alpha多樣性結(jié)果見表4。4個土壤樣本覆蓋率均達到99.3%以上，說明測序深度較高，基本能覆蓋樣品中所有物種，能夠真實地反映土壤微生物的群落組成。

細菌群落結(jié)構(gòu)豐富度和多樣性主要是由代表OTUs統(tǒng)計的物種數(shù)Observed spieces、表征菌群豐度的Chao 1指數(shù)（Chao 1 index），以及反映菌群多樣性的香濃指數(shù)（Shannon index）和辛普森指數(shù)（Simpson index）來表示。從表4可以看出，隨著化肥用量的增加，土壤物種數(shù)、Chao 1指數(shù)、進化多樣性指數(shù)（Faith’s PD）均逐漸降低，其中CMR90處理組Chao 1指數(shù)、土壤物種數(shù)顯著低于其他各處理組，進化多樣性指數(shù)僅顯著低于CMR60處理組，其他各處理組之間的土壤物種數(shù)、Chao 1指數(shù)、進化多樣性指數(shù)均無顯著差異。香濃指數(shù)隨著化肥使用量的增高出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在CMR70處理組達到最高值，但各處理之間不具有顯著差異。這說明化肥的施用量能夠影響土壤細菌群落的豐富度和多樣性。

表4 不同處理土壤細菌菌群的豐度和多樣性比較

2.5 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析

在門水平上，4組土壤樣品中優(yōu)勢細菌從高到低依次為變形菌門Proteobactreia、放線菌門Actinobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、綠彎菌門Chloroflexi、擬桿菌門Bacteroidetes（圖3）。其中，變形菌門和放線菌門在各處理樣品中占比最大，為本研究區(qū)土壤優(yōu)勢細菌的菌門。在不同處理下的土壤樣品中，變形菌門相對豐度大小依次是CMR60（38.45%）＞CMR70（37.48%）＞CMR90（36.87%）＞CMR80（36.39%）；放線菌門相對豐度大小依次是CMR80（18.86%）＞CMR60（18.48%）＞CMR70（17.51%）＞CMR90（16.68%）；酸桿菌門相對豐度大小依次是CMR70（11.30%）＞CMR80（9.96%）＞CMR90（9.57%）＞CMR60（8.47%）；芽單胞菌門相對豐度大小依次是CMR90（10.47%）＞CMR70（8.29%）＞CMR60（8.26%）＞CMR80（8.05%）；綠彎菌門相對豐度大小依次是CMR80（8.94%）＞CMR60（8.65%）＞CMR90（8.55%）＞CMR70（8.14%）；擬桿菌門相對豐度大小依次是CMR80（8.39%）＞CMR90（8.00%）＞CMR60（7.83%）＞CMR70（7.32%）。總體來看，CMR60處理組土壤樣品中變形菌門相對豐度較其他處理組高，CMR70處理組土壤樣品中酸桿菌門相對豐度較其他處理組高，CMR80處理組土壤樣品中放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門相對豐度較其他處理組高，CMR90處理組土壤樣品中芽單胞菌門相對豐度較其他處理組高。

圖3 門水平上土壤細菌菌群的組成結(jié)構(gòu)

在屬水平上，不同處理的優(yōu)勢菌屬基本相似，分別為MND1、Subgoup10、Iamia、特呂珀菌屬Truepera、Pelagibius、鏈霉菌屬Streptomyces、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、芽單胞菌屬Gemmatimonas、交替赤桿菌屬Altererythrobacter、假單胞菌屬PseudCMRonas、鞘脂單胞菌屬SphingCMRonas、RB41、馬杜拉放線菌屬Actinomadura、溶桿菌屬Lysobacter、硝化螺菌屬Nitrospira、Haliangium、類諾卡氏屬Nocardioides、藤黃色單胞菌屬Luteimonas、芽孢桿菌屬Bacillus、Ilumatobacter（圖4）。其中，CMR60處理組土壤樣品中的優(yōu)勢屬（相對豐度＞1%）依次是MND1 2.82%、Iamia1.28%、馬杜拉放線菌屬1.18%、鏈霉菌屬1.15%、Pelagibius1.14%、特呂珀菌屬1.09%；CMR70處理組土壤樣品中的優(yōu)勢屬（相對豐度＞1%）依次是MND1 2.87%、Subgroup10 1.51%、Iamia1.26%、假單胞菌屬1.20%、RB41 1.06%、鞘脂單胞菌屬1.04%；CMR80處理組土壤樣品中的優(yōu)勢屬（相對豐度＞1%）依次是MND1 2.34%、假單胞菌屬1.30%、Iamia1.21%、Subgroup10 1.20%、鏈霉菌屬1.00%；CMR90處理組土壤樣品中的優(yōu)勢屬（相對豐度＞1%）依次是MND1 2.08%、特呂珀菌屬1.41%、Iamia1.31%、Pelagibius1.25%、Subgroup10 1.24%、蒼白桿菌1.19%。另外，MND1、RB41、鞘脂單胞菌屬、溶桿菌屬、Nitrospira的相對豐度在4個處理組中出現(xiàn)了先升高后逐步減低的趨勢，在CMR70處理組中達到最高值。

圖4 屬水平上土壤細菌菌群的組成結(jié)構(gòu)

2.6 土壤菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的冗余分析

采用冗余分析（RDA）方法探討了土壤理化性質(zhì)與細菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系（圖 5）。圖中不同顏色的點表示不同處理的樣品，各處理樣品分布點并沒有顯著地分隔開，說明不同施肥處理對土壤細菌群體結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生顯著的影響。圖5中紅色箭頭分別代表不同的環(huán)境因子，藍色箭頭代表不同的微生物。環(huán)境因子之間的夾角為銳角時，表示2個環(huán)境因子之間呈正相關(guān)，鈍角時則呈負相關(guān)。物種與環(huán)境因子之間的夾角代表物種與環(huán)境因子間的正、負相關(guān)關(guān)系（銳角：正相關(guān)；鈍角：負相關(guān)；直角：無相關(guān)性），環(huán)境因子的射線越長，說明該影響因子的影響程度越大。

從圖5可以看出，pH值與總磷之間呈正相關(guān)，兩者與總鉀呈正相關(guān)，與有機質(zhì)、總氮呈負相關(guān)；有機質(zhì)與總氮之間呈正相關(guān)?？傗泴Ω魈幚砑毦郝浣Y(jié)構(gòu)的影響程度最大，其次是總磷和pH值?？傗浥c蒼白桿菌屬、Pelagibius、特呂珀菌屬呈正相關(guān)，與Subgoup10、Iamia、MND1、鏈霉菌屬、馬杜拉放線菌屬、溶桿菌屬呈負相關(guān)；總磷、pH值與芽單胞菌屬、硝化螺菌屬、RB41呈正相關(guān)，與溶桿菌屬、馬杜拉放線菌屬、鏈霉菌屬、Iamia呈負相關(guān)；總氮、有機質(zhì)與溶桿菌屬、交替赤桿菌屬、馬杜拉放線菌屬、假單胞菌屬呈正相關(guān)，與硝化螺菌屬、RB41、鞘脂單胞菌屬、芽單胞菌屬呈負相關(guān)。

圖5 基于屬水平細菌群落的組成與土壤理化性質(zhì)的RDA分析

3 結(jié)果與分析

本研究結(jié)果顯示，不同施肥處理后土壤有機質(zhì)含量由高到低依次為CMR80＞CMR90＞CMR60＞CMR70。CMR80處理組的土壤全氮含量增加，全磷、全鉀含量降低，其他各處理組的土壤氮、磷、鉀養(yǎng)分含量與處理前無明顯變化。從處理后的土壤養(yǎng)分含量可以看出，中藥渣有機肥的施用能夠顯著增加土壤有機質(zhì)含量，而不同化肥施用量處理對土壤有機質(zhì)、氮、磷、鉀養(yǎng)分的利用效果也各不相同。從番茄長勢來看，CMR70處理組的番茄植株長勢相對較好；從產(chǎn)量、品質(zhì)數(shù)據(jù)來看，CMR70處理組番茄產(chǎn)量相對較高，且可滴定酸含量相對較低，口感較好。

從土壤樣品的Alpha 多樣性分析結(jié)果可以看出，在中藥渣有機肥施用量一定的前提下，隨著化肥用量的增加，土壤物種數(shù)、土壤Chao 1指數(shù)、進化多樣性指數(shù)均逐漸降低。其中，CMR90處理組化肥施用量最高，其土壤微生物Chao 1指數(shù)、物種數(shù)最低，且顯著低于其他各處理組；進化多樣性指數(shù)最低，且顯著低于CMR60處理組，與其他處理組無顯著差異。CMR70、CMR80、CMR90處理組的物種數(shù)、Chao 1指數(shù)、進化多樣性指數(shù)均無顯著差異。香濃指數(shù)隨著化肥使用量的增高出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并在CMR70處理組達到最高值。這充分說明化肥的施用量能夠影響土壤細菌群落的豐富度和多樣性，在中藥渣有機肥施用量一定的前提下，施用化肥的量越多，土壤微生物的多樣性反而越低。

從土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析可以看出，不同處理組土壤中的優(yōu)勢菌門基本相似，分別為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、擬桿菌門，這與之前的研究結(jié)果相似［25-26］，但各處理中優(yōu)勢菌門的相對豐度具有一定差異，CMR60處理組中變形菌門相對豐度較高，CMR70處理組中酸桿菌門相對豐度較高，CMR80處理組中放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門相對豐度較高，CMR90處理組中芽單胞菌門相對豐度較高。這也說明了在中藥渣有機肥施用量一定的前提下，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受化肥施用量的影響。

在本研究中，土壤變形菌門占絕對優(yōu)勢，與之前很多土壤細菌群落研究的結(jié)果相似，都具有很高的相對豐度［27-28］。變形菌門屬于異養(yǎng)型細菌，包含有能與植物共生的固氮細菌，可以增強土壤的固氮能力。有研究表明，土壤變形菌門豐富度的高低在一定程度上反映了土壤有機質(zhì)等養(yǎng)分含量的高低［29-30］。放線菌是一類具有重要生物活性的功能性微生物，能產(chǎn)生種類繁雜和富含生物活性的次級代謝產(chǎn)物，還能產(chǎn)生各類酶、有機酸等，有助于分解有機物和礦物質(zhì)［31］，同時它具有良好的抗菌活性和耐鹽堿作用［32-33］。酸桿菌門細菌也是土壤微生物的重要成員，在土壤物質(zhì)循環(huán)和生態(tài)環(huán)境構(gòu)建過程中起到非常重要的作用［34-35］。Fierer 等［36］研究發(fā)現(xiàn)，施氮量對細菌多樣性沒有產(chǎn)生顯著的影響，但施氮對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響顯著，其中富營養(yǎng)細菌，如變形菌門和擬桿菌門相對豐度隨施氮量的增加而上升，而寡營養(yǎng)細菌主要是酸桿菌卻表現(xiàn)出相反的趨勢。Ramirez 等［37］對采自不同生態(tài)環(huán)境下的 28 個土壤氮素添加試驗發(fā)現(xiàn)，施氮增加了放線菌和Firmicute細菌的相對豐度，但降低了酸桿菌和Verrucomicrobia細菌的相對豐度。本研究結(jié)果顯示，隨著氮磷鉀肥料施用量的增加，酸桿菌門的相對豐度出現(xiàn)了先升高后降低的趨勢，與之前的研究不盡相同。綠彎菌門是一類通過光合作用產(chǎn)生能量的細菌，廣泛分布在生物圈的各種環(huán)境中，參與了 C、N、S 等元素的生物地球化學循環(huán)，是所在環(huán)境生態(tài)學過程的重要參與者［38］。擬桿菌具有溶磷作用，一些菌屬能夠分泌有機酸和磷酸酶將難溶性磷轉(zhuǎn)化為可以被植物吸收利用的H2PO4-和 HPO42-這2種磷的形態(tài)［39］，提高了植物對磷的吸收和利用，促進了植物生長［40］。

通過冗余分析可知，有機質(zhì)和全氮、全磷、全鉀對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)都有影響，其中全鉀的影響程度最大，可能是由于有機質(zhì)及氮、磷、鉀養(yǎng)分為土壤微生物提供了重要的能量來源，促進了土著優(yōu)勢種群的生長繁殖，而不利于一些非優(yōu)勢種群及對環(huán)境變化敏感種群微生物的生長與豐度的增加，但隨著養(yǎng)分的過量積累反而不利于土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成的變化［41-43］。