譚一羅，張廣旭，王康君，郭明明，孫中偉，李曉峰，樊繼偉

（連云港市農(nóng)業(yè)科學院，江蘇 連云港 222000）

小麥（Tritium aestivumL.）作為世界主要糧食作物之一，小麥的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)在保障糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中占有重要地位［1］。為了應對各種逆境環(huán)境，植物在生長過程中進化出多種脅迫響應和免疫應答機制。研究表明，苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）基因家族參與了植株對各種逆境脅迫的適應和抵抗，在植物生長發(fā)育和環(huán)境互作中起重要作用，常被用作衡量植物抗逆性的指標之一。PAL基因屬于裂解酶類超家族基因，作為苯丙烷類代謝的第1個酶，產(chǎn)生各種次級代謝物的前體，編碼多種保護性化合物，廣泛存在于高等植物和微生物中。苯丙烷類代謝是植物苯丙烷類骨架物質產(chǎn)生的一條重要次生代謝途徑，其直接或間接產(chǎn)生具有植物生長發(fā)育、植物抗逆反應、活性氧清除和抗毒素等多種與生物功能相關的次級代謝產(chǎn)物，如與細胞壁形成相關物質、酚類和黃酮類化合物、生物堿等［2-3］。對小麥PAL基因及其編碼蛋白質和功能進行研究，有助于闡明其在小麥生長發(fā)育和免疫防御中的作用，為小麥逆境脅迫中的反應機制和抗性育種研究提供新思路。本文對小麥PAL基因序列特征、蛋白質結構特征和表達特性，以及其在小麥脅迫響應中的分子機制和功能進行了系統(tǒng)綜述。

1 小麥PAL基因的序列特征

植物PAL基因通常編碼包含700個氨基酸左右的蛋白質，蛋白質編碼區(qū)長度在2100 bp左右，大部分gDNA包含2個外顯子和1個內含子，不同植物間內含子長度變化較大［4］。植物PAL基因家族是一個龐大的多基因家族，研究報道玉米中有10個PAL，擬南芥和煙草中有4個PAL，西紅柿和馬鈴薯中有超過20個PAL［5～8］。Rasool等［9］研究了小麥PAL基因的基因結構、保守結構域和順式調控元件，研究表明普通小麥中有37個PAL家族基因，覆蓋11條染色體，呈不均勻分布。小麥PAL基因數(shù)量顯著高于其他物種，推測是因小麥全基因組重復、小規(guī)模節(jié)段重復、串聯(lián)重復等事件發(fā)生導致的。虞光輝等［10］從小麥品種蘇麥3號中克隆了4個PAL基因，其開放閱讀框（ORF，open reading frame）長度在2016～2142 bp，編碼672～714個氨基酸，4個PAL基因序列相似性為88.35%，分別位于小麥6B、2D和2B染色體上，其中TaPAL2和TaPAL4均位于2D染色體。李秋娥等［11］研究表明單子葉植物PAL基因密碼子受到突變與自然選擇雙重影響，偏好以G/C編碼。

2 PAL蛋白質的結構特征和表達特性

雖然植物PAL蛋白在不同物種間數(shù)量差異較大，但保守性極高，其酶活性位點主要存在于PAL-HAL結構域上，且大都含有GTITASGDLVPL SYIAG酶活性中心序列［12-13］。第1種植物PAL是在歐芹（Petroselinum crispum）中以晶體形式發(fā)現(xiàn)。小麥編碼的PAL蛋白同屬于PAL基因家族，通常包含498～714個氨基酸，分子量在52.78～77.34 kDa，平均分子量為74.97 kDa，等電點為5.76～7.57，大多呈酸性。Rasool等［9］研究發(fā)現(xiàn)37個小麥PAL基因編碼的蛋白質均包含HAL-PAL結構域。研究表明小麥品種蘇麥3號編碼的4個PAL氨基酸相似性高達91.92%，均為弱酸性的親水蛋白［10］。同源模建（圖1）顯示小麥PAL與歐芹PAL相似性為74.29%，蛋白質二級結構均含有α-螺旋、β-折疊等結構。植物PAL的分布與細胞分化程度有關，其表達具有組織器官特異性，PAL基因大多在植物成熟的花和根部表達量較高，其次為莖部，在成熟植物葉片中較難檢測到其表達。

3 PAL響應植物逆境的分子機制

PAL作為苯丙烷類代謝的限速酶，一方面將L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）作為底物，催化氨和反式肉桂酸（trans-Cinnamate）的合成［14］（圖1A），為下游木質素等次級代謝產(chǎn)物合成提供底物；另一方面，PAL能直接以L-酪氨酸（L-Tyrosine）為底物生成4-香豆酸（4-Coumarate）（圖1B），通過苯丙烷類途徑間接影響植保素合成。木質素是一種復雜的外消旋芳香族多聚合物，由羥基肉桂醇單體甲氧基化而來，為植物提供機械支撐、運輸水和養(yǎng)分，通過加強木質素在植物次生細胞壁中的沉積來增厚細胞壁，從而在植物逆境中形成物理屏障，進而提高植物抗性［15-16］。黃酮類化合物是一類以2-苯基色酮為基礎的酚類化合物，可以通過抑制病原體分泌的植物細胞壁降解酶活性來保護植物細胞壁的完整性。Kim等［17］發(fā)現(xiàn)擬南芥MYB15通過激活PAL等木質素合成相關基因抵御病原體感染，且木質素單體松柏醇的外源供應能恢復MYB15缺陷植株對病原體的免疫。植物能夠通過調節(jié)PAL基因表達來調控苯丙烷類途徑中次級代謝產(chǎn)物的含量，如異黃酮、類黃酮、酚酸等，從而影響植株對干旱、營養(yǎng)缺失、鹽脅迫、重金屬等非生物脅迫和生物脅迫的響應［18-25］。Wu等［26］根據(jù)PAL在小麥赤霉病侵染中的早期表達推測其可能在赤霉病TypeⅠ抗侵染（resistance to initial infection）中起作用，但主要功能是激活在Type Ⅱ抗擴展（resistance to fungal spread within the infected spikes）中發(fā)揮作用的苯丙烷類途徑。此外，PAL還能通過影響水楊酸（salicylic acid，SA）和下游次級代謝物的合成來應對逆境。Shine等［27］發(fā)現(xiàn)黃豆中PAL與異分支酸合成酶共同參與SA的合成，進而影響植物免疫應答。

圖1 PAL蛋白質同源模建

4 PAL在小麥逆境脅迫中的功能

4.1 PAL響應小麥非生物脅迫

近年來研究表明，PAL基因在植物生長中發(fā)揮重要作用，且在非生物脅迫下受到誘導表達，如重金屬脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫等。Wei等［28］研究了普通小麥的D基因組供體山羊草（Aegilops tauschii），發(fā)現(xiàn)AetSRG1的蛋白質與PAL相互作用，且AetSRG1可以穩(wěn)定PAL并促進內源性SA的合成，進而響應鎘脅迫。PAL作為小麥鹽脅迫耐受性的評價指標，研究表明鹽脅迫條件下小麥根系Na+含量增加，PAL活性增強，且相較于耐鹽基因型小麥品種，鹽脅迫對鹽敏感基因型小麥的影響更顯著［29-30］。Wang等［31］研究表明低溫脅迫使PAL和內源性SA的表達水平顯著上調，PAL（作為參與SA生物合成的關鍵酶）和SA在小麥抗凍反應中可能涉及抗氧化能力和冷響應基因的表達調節(jié)。Kolupaev等［32］發(fā)現(xiàn)H2S處理下小麥通過PAL活性的調控影響植株類黃酮化合物積累，從而提高小麥幼苗對低溫脅迫的抗性。Li等［33］研究表明干旱脅迫下灌漿期小麥的旗葉和穗部PAL等苯丙烷類途徑相關酶活性呈先增后減的趨勢，說明干旱脅迫促進了這些酶活性的升高。Koramutla等［34］發(fā)現(xiàn)小麥在水淹脅迫下通過PAL和異分支酸合酶基因表達來提高莖節(jié)中SA含量，進而在乙烯作用下誘導通氣組織形成。

圖2 PAL催化反應

4.2 PAL參與小麥抗蟲防御反應

Leon 等［35］使用VIGS靶向沉默具有蚜蟲抗性的俄羅斯小麥的WRKY53 和PAL基因表達，沉默后其基因轉錄本豐度均降低到與易感小麥相似水平，植株在蚜蟲侵染時都表現(xiàn)出易感表型，且WKRY53 的沉默也抑制了PAL表達，推測這些基因在相同的防御反應網(wǎng)絡中發(fā)揮關鍵作用。Zhang 等［36］研究發(fā)現(xiàn)易變山羊草中AevPAL1基因能通過影響水楊酸（sodium salicylate，SA）和下游次級代謝物的合成，進而調控植株對禾谷孢囊線蟲（cereal cyst nematode，CCN）的抗性，且在易變山羊草中沉默AevPAL1后CCN感染發(fā)生率明顯提高，而過表達AevPAL1能夠顯著增強小麥的CCN抗性，并且對小麥生長及產(chǎn)量等性狀無明顯影響。

4.3 PAL參與小麥抗病防御反應

隨著多組學技術的發(fā)展，近年來研究表明小麥PAL基因的表達與小麥赤霉病等病害應答反應密切相關，推測該基因參與了小麥對病原菌的防御過程。Kosova等［37］研究發(fā)現(xiàn)蘇麥3號接種鐮刀菌和DON毒素會顯著增加應激保護蛋白的合成，PAL、BAHD?；D移酶等顯著積累，這可能是蘇麥3號品種抗性優(yōu)越的基礎。Li等［38］從轉錄水平證實了小麥PAL基因在稈銹菌誘導的抗性反應中發(fā)揮重要作用。Sorahinobar等［39］研究表明SA能提高小麥對赤霉病的防御能力，提前施用SA能夠促進PAL、CYP450等基因的表達，推測這些基因與小麥赤霉病防御存在關聯(lián)。Duba等［40］研究表明，小麥高表皮毛狀體密度在抵抗鐮刀菌侵染方面起關鍵作用，且接種鐮刀菌后抗性品種的PAL活性和ROS含量顯著高于易感小麥。Kage等［41］利用小麥的兩個不同赤霉病抗性的近等基因系（易感NIL-S和抗性NIL-R），對其接種禾谷鐮刀菌后進行代謝組研究，并基于QTL-2DL位點將GPAT、ABC轉運蛋白基因、CER5和PAL基因作為候選基因，且這些候選基因在NIL-R中的轉錄水平較NIL-S顯著上調，說明它們可能參與了抗性相關代謝物的生物合成。此外，該研究發(fā)現(xiàn)小麥小穗對赤霉病的抗性主要是通過角質和木栓質分子沉積，從而增強細胞壁來抵抗病原菌侵染。

5 小結

隨著生物工程技術的飛速發(fā)展，通過正向遺傳學或多組學分析手段闡明小麥逆境響應機制，挖掘相關抗性基因成為可能，小麥參與植物抗逆反應的各種生物學過程不斷被發(fā)現(xiàn)。挖掘小麥逆境脅迫下的調控分子網(wǎng)絡，完善小麥逆境響應的分子機制，對小麥抗逆品種遺傳改良有重要理論價值和應用前景。