朱加武，李輝

（1.西安海欣制藥有限公司，陜西 西安 710075；2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；3.陜西盛德泰林生物安全技術(shù)檢測(cè)有限公司，陜西 西安 710077）

非無菌藥品中污染微生物數(shù)量應(yīng)控制在滿足患者用藥安全的限度范圍內(nèi)［1］，若控制不足，會(huì)導(dǎo)致藥品的安全性問題；過度控制，會(huì)增加復(fù)雜性及提高成本，而無相應(yīng)的安全收益，不利于產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此，采用科學(xué)的方法評(píng)估非無菌藥品生物負(fù)載的安全風(fēng)險(xiǎn)是進(jìn)行適當(dāng)微生物控制的重要措施。中藥飲片為非無菌藥品，含有一定量微生物，若在采收、炮制、運(yùn)輸、貯藏等環(huán)節(jié)未有效控制，會(huì)導(dǎo)致微生物增殖，影響其安全性和有效性。2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》新增了中藥飲片微生物限度檢查法，其中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、耐熱菌總數(shù)等指標(biāo)均反映中藥飲片污染微生物的數(shù)量［2］，以中藥飲片生物負(fù)載描述。目前，中藥飲片生物負(fù)載的主要類型是需氧菌，平均對(duì)數(shù)值為4.7，霉菌和酵母菌總數(shù)、耐熱菌總數(shù)的平均對(duì)數(shù)值為2～3［3］，污染微生物的分布具有不均一性和高度不確定性［4］。近年來，諸多學(xué)者對(duì)中藥飲片污染微生物狀況進(jìn)行了研究，積累了豐富的數(shù)據(jù)資料，亟待對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析，為中藥飲片微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的制訂和控制提供參考。為此，本研究中建立了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具量化評(píng)估方法，為探索中藥飲片微生物風(fēng)險(xiǎn)管理和控制提供了新思路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法的建立

1.1 文獻(xiàn)篩選

采用計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于中藥飲片污染微生物的相關(guān)文獻(xiàn)，檢索時(shí)間為2012年1月1日至2022 年1 月1日，檢索關(guān)鍵詞為“中藥飲片”“飲片”“中藥”“微生物”“細(xì)菌”“耐熱菌”“需氧菌總數(shù)”“霉菌和酵母菌總數(shù)”“耐膽鹽革蘭陰性菌”。

共檢索到相關(guān)文獻(xiàn)135篇，確定相關(guān)研究文獻(xiàn)29篇，剔除信息不完整、表述模糊、數(shù)據(jù)重復(fù)的文獻(xiàn)，最終納入17篇。為了便于統(tǒng)計(jì)與分析，對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，規(guī)定測(cè)定結(jié)果低于10 cfu/ g，對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后以0.5計(jì)。

1.2 方法

為了進(jìn)行中藥飲片生物負(fù)載的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，建立中藥飲片生物負(fù)載失效模式與影響分析（FMEA）模型，從生物負(fù)載檢測(cè)的難易程度（DET）、被報(bào)道的頻率、可能造成的危害嚴(yán)重程度（SEV）等方面評(píng)估生物負(fù)載的安全風(fēng)險(xiǎn)。

生物負(fù)載是否影響中藥飲片的安全是多因素綜合作用的結(jié)果，為簡(jiǎn)化問題，確定關(guān)鍵因素進(jìn)行分析。其中，DET 為檢測(cè)方法執(zhí)行的難易程度，取決于樣品和方法2 個(gè)因素；被報(bào)道的頻率即發(fā)生的可能性（OCC），為生物負(fù)載在所統(tǒng)計(jì)的文獻(xiàn)中所用樣品的量，樣品量大則代表性強(qiáng)；SEV為某類型的生物負(fù)載對(duì)中藥飲片的危害程度，主要取決于是否符合相應(yīng)生物負(fù)載的限度標(biāo)準(zhǔn)或參考標(biāo)準(zhǔn)。為確定風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)并采取措施降低中藥飲片的生物負(fù)載提供量化分析工具，SEV主要考慮中藥飲片生物負(fù)載指標(biāo)是否符合相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和中藥飲片的服用方式2個(gè)關(guān)鍵因素。通過評(píng)估生物負(fù)載對(duì)中藥飲片安全性的影響，形成低、中、高3 個(gè)不同的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)。按上述方法建立中藥飲片生物負(fù)載風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，詳見表1。

表1 基于FMEA模型的中藥飲片生物負(fù)載風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型Tab.1 Assessment model of bioburden risk for TCM decoction pieces based on the FMEA model

需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、耐熱菌總數(shù)是中藥飲片的微生物學(xué)指標(biāo)，主要反映中藥飲片的衛(wèi)生狀況。目前，2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和中藥飲片微生物限度檢查法項(xiàng)下，僅對(duì)直接口服及泡服的中藥飲片的需氧菌總數(shù)及霉菌和酵母菌總數(shù)作了規(guī)定，對(duì)煎煮類中藥飲片的微生物限度，以及耐熱菌總數(shù)的限度標(biāo)準(zhǔn)尚無規(guī)定［2］。為了深入了解中藥飲片的安全風(fēng)險(xiǎn)，參考《歐洲藥典10.0 版》［5］、《日本藥局方17 版》［6］對(duì)煎煮類中藥飲片的微生物限度要求進(jìn)行分析，參考2020 年版《中國(guó)藥典》微生物通則草案（一）第一次征求意見稿［7］對(duì)耐熱菌限度進(jìn)行分析。是否符合可接受最大菌數(shù)對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 基于FMEA模型的中藥飲片生物負(fù)載風(fēng)險(xiǎn)嚴(yán)重程度的判定標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Criteria for the severity of the bioburden risk of TCM decoction pieces based on the FMEA model

1.3 風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)確定

根據(jù)生物負(fù)載是否超標(biāo)及對(duì)中藥飲片造成的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，以風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)（RPN）定量描述風(fēng)險(xiǎn)的大小，RPN=SEV × OCC × DET。按RPN 值的大小確定風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，RPN 為1～4 判定為低風(fēng)險(xiǎn)，為6～12 判定為中風(fēng)險(xiǎn)，為18～27 判定為高風(fēng)險(xiǎn)。考慮中藥飲片生物負(fù)載的復(fù)雜性，為了彌補(bǔ)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法的不足，需對(duì)RPN 評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行部分修正，當(dāng)SEV為1時(shí)，無論RPN值為多少，均認(rèn)為是低風(fēng)險(xiǎn)；當(dāng)SEV為3時(shí)，無論RPN值為多少，均認(rèn)為是高風(fēng)險(xiǎn)。但豆豉、神曲等發(fā)酵類中藥飲片除外，需綜合考慮而評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)。

2 中藥飲片生物負(fù)載的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

2.1 需氧菌總數(shù)

分析54 個(gè)中藥飲片的59 組、756 批次需氧菌總數(shù)的研究數(shù)據(jù)，結(jié)果見表3?？芍?，高風(fēng)險(xiǎn)4組（6.78%），中風(fēng)險(xiǎn)9 組（15.25%），低風(fēng)險(xiǎn)46 組（77.97%）；熟地黃、白術(shù)、海螵蛸（均為低風(fēng)險(xiǎn)）2 組的評(píng)估結(jié)果一致，合歡皮（高風(fēng)險(xiǎn)和中風(fēng)險(xiǎn)）和甘草（中風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)）2 組的評(píng)估結(jié)果不一致，表明中藥飲片污染生物負(fù)載存在分布不均一性；松花粉、蒲黃、魚腥草、合歡皮4 個(gè)品種中藥飲片的需氧菌總數(shù)風(fēng)險(xiǎn)較高，其中松花粉、蒲黃為粉末狀態(tài)，比表面積大，易導(dǎo)致污染和微生物滋生，松花粉與魚腥草為藥食同源類中藥飲片，泡服應(yīng)關(guān)注其高生物負(fù)載導(dǎo)致的風(fēng)險(xiǎn)；淡豆豉為微生物發(fā)酵類中藥飲片，SEV雖為3，實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)不高，故修正為低風(fēng)險(xiǎn)。

表3 中藥飲片需氧菌總數(shù)及生物負(fù)載風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估Tab.3 Total aerobic microbial count in TCM decoction pieces and risk assessment of bioburden

2.2 霉菌和酵母菌總數(shù)

分析53 個(gè)中藥飲片的58 組、712 批次霉菌和酵母菌總數(shù)的研究數(shù)據(jù)，結(jié)果見表4。可知，高風(fēng)險(xiǎn)2組（3.45%），中風(fēng)險(xiǎn)10 組（17.24%），低風(fēng)險(xiǎn)46 組（79.31%）；白術(shù)、甘草、海螵蛸、熟地黃（均為低風(fēng)險(xiǎn)）和合歡皮（均為中風(fēng)險(xiǎn)）2 組的評(píng)估結(jié)果均一致；松花粉、魚腥草2 種藥食同源類中藥飲片的霉菌和酵母菌總數(shù)風(fēng)險(xiǎn)高。淡豆豉為發(fā)酵類中藥飲片，陳麗艷等［26］從6 個(gè)產(chǎn)地淡豆豉中共分離出3 株細(xì)菌和11 株霉菌，其中霉菌中的曲霉菌和毛霉菌為優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌，表明該品種自身特點(diǎn)決定了其生物負(fù)載風(fēng)險(xiǎn)較高，對(duì)其風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)進(jìn)行了再修正。部分中風(fēng)險(xiǎn)中藥飲片的霉菌和酵母菌污染量較高，該類品種在保證生物負(fù)載降低的同時(shí)，還應(yīng)考慮溫度、水分活度、基質(zhì)等因素，防止真菌毒素產(chǎn)生［27］。

表4 中藥飲片霉菌和酵母菌總數(shù)及生物負(fù)載風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估Tab.4 Total mold and yeast count in TCM decoction pieces and risk assessment of bioburden

2.3 耐熱菌總數(shù)

中藥飲片中的耐熱菌以芽孢桿菌為主，包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等［3，18，28-31］。分析51個(gè)中藥飲片的55組、622批次耐熱菌總數(shù)的研究數(shù)據(jù)，結(jié)果見表5?？芍唢L(fēng)險(xiǎn)2 組（3.64%），中風(fēng)險(xiǎn)6 組（10.91%），低風(fēng)險(xiǎn)47 組（85.45%）；白術(shù)、熟地黃、合歡皮（均為低風(fēng)險(xiǎn)）2 組的評(píng)估結(jié)果一致，海螵蛸（中風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)）2 組的評(píng)估結(jié)果不一致，說明中藥飲片污染生物負(fù)載存在分布不均一性；松花粉、淡豆豉為藥食同源類中藥飲片，高生物負(fù)載使污染微生物在泡服或煎煮中存活，風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較高，故此項(xiàng)下未調(diào)整其風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)。

表5 中藥飲片耐熱菌總數(shù)及生物負(fù)載風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估Tab.5 Total thermotolerant bacteria count in TCM decoction pieces and risk assessment of bioburden

2.4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

從風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果看，中藥飲片生物負(fù)載高風(fēng)險(xiǎn)占3.45%～6.78%，以需氧菌占比最高；中風(fēng)險(xiǎn)占10.91%～17.24%，以霉菌和酵母菌總數(shù)占比最高；低風(fēng)險(xiǎn)占77.97%～85.45%，以耐熱菌總數(shù)占比最高。從品種上看，松花粉、魚腥草等藥食同源類中藥飲片的生物負(fù)載風(fēng)險(xiǎn)較高，大多數(shù)中藥飲片的生物負(fù)載風(fēng)險(xiǎn)可控。從同品種評(píng)估結(jié)果一致性角度看，部分中藥飲片評(píng)估結(jié)果不一致，表明生物風(fēng)險(xiǎn)負(fù)載的分布不均一，污染程度不一致。

3 討論

本研究中中藥飲片的生物負(fù)載風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估建立在已有研究數(shù)據(jù)的回顧性分析基礎(chǔ)上，由于收集樣品的數(shù)量、品種均有一定局限性，不能全面表征中藥飲片的微生物污染特征［32］，盡管對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法進(jìn)行了修正處理，但評(píng)估結(jié)果仍可能存在偏差。我國(guó)中藥飲片整體生產(chǎn)水平和技術(shù)條件不及發(fā)達(dá)國(guó)家，產(chǎn)品普遍存在微生物污染，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)管理的理念值得借鑒和參考［33］。

對(duì)于豆豉、神曲等微生物發(fā)酵類中藥飲片，生物負(fù)載風(fēng)險(xiǎn)較高，且微生物本身可能是其一部分，需綜合判定其風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，不適用于直接采用本研究中建立的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。若直接采用定量化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法，而不考慮此類中藥飲片的特殊性和復(fù)雜性，將導(dǎo)致錯(cuò)誤判斷，故需對(duì)該類中藥飲片的判定結(jié)果進(jìn)行修正。

建議在建立中藥質(zhì)量等級(jí)評(píng)價(jià)體系時(shí)［34］，考慮生物負(fù)載對(duì)其質(zhì)量造成的風(fēng)險(xiǎn)。中藥飲片的等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)寬松［35］，需建立與其質(zhì)量密切相關(guān)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。中藥飲片生物負(fù)載定量化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法的應(yīng)用，為針對(duì)不同風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的品種和指標(biāo)制訂差異化控制策略、精準(zhǔn)控制微生物風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。如松花粉、魚腥草、蒲黃等中藥飲片，應(yīng)引導(dǎo)市場(chǎng)規(guī)范生產(chǎn)、增強(qiáng)意識(shí)，強(qiáng)化過程控制，逐步降低生物負(fù)載風(fēng)險(xiǎn)；如酒女貞子、自然銅等中藥飲片，應(yīng)逐步放寬限制，平衡風(fēng)險(xiǎn)收益；如枸杞等中藥飲片，應(yīng)關(guān)注飲片凈制工藝、趁鮮加工工藝、炮制程度等研究［36］，控制水分活度等關(guān)鍵指標(biāo)［37-38］，關(guān)注貯藏環(huán)節(jié)的環(huán)境控制與污染微生物的引入［39］，防止污染微生物的生長(zhǎng)繁殖。