劉玉明，蔣定文，李珂嫻，陳偉，何穎

（中國人民解放軍海軍特色醫(yī)學(xué)中心，上海 200433）

在航海特殊作業(yè)環(huán)境中，海軍部隊常受輻射、噪聲、振動、有害氣體、天氣炎熱、空氣潮濕等各種外來因素的侵襲，加之淡水缺乏、蔬菜較少，免疫功能下降已成為廣大官兵的常見癥狀。近年來，隨著海軍戰(zhàn)略轉(zhuǎn)型的推進，由近海防御轉(zhuǎn)向遠海護衛(wèi)，海軍軍事訓(xùn)練頻次增多、任務(wù)加重［1］，高強度訓(xùn)練會引起機體免疫功能下降［2］。增強部隊官兵免疫力，有效提高作業(yè)能力和作戰(zhàn)效能，這已是廣大科研學(xué)者亟需研究的重要課題。銀參膠囊以刺五加提取物、銀耳提取物、維生素C 等為主要原料，主治脾腎陽虛、體虛乏力、食欲不振［3］，對提高機體免疫力有重要作用［4-5］。《中藥大辭典》《實用中藥手冊》記載，銀耳滋陰潤肺，養(yǎng)胃生津；《中國藥用真菌圖鑒》指出，銀耳益氣、強心、補腎，提高機體免疫功能作用良好［6-7］。課題組之前已對銀參膠囊的毒性［8-9］、中試制備工藝［10］和穩(wěn)定性［11］進行了研究。本研究中探討了銀參膠囊調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用，為提高部隊?wèi)?zhàn)斗力提供新品種。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：AL204型電子天平（瑞士Mettler公司）；LD5-2A型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；550型酶標(biāo)儀（Biorad公司）；7200 分光光度計（日本島津公司）；HERA cell 150i型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Electron 公司）；DHG -9140A型烤箱（上?；厶﹥x器制造有限公司）；XDS-1B型顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；NU -430 -400E型超凈工作臺（美國Nuaire公司）。

試藥：銀參膠囊（上海麥迪普生物有限公司，批號為Y12061331）；刀豆蛋白A（ConA，上海Aladdin 公司，批號為D1328039）；二硝基氟苯（上海西亞試劑有限公司，批號為20120618）；RPMI 1640 培養(yǎng)液（Gibco 公司，批號為6123018）；小牛血清（杭州天杭生物科技有限公司，批號為121218）；YAC -1 細胞株（上海名勁生物科技有限公司）；Giemsa 染液（美國Sigma 公司，批號為BCBF9150）；碘伏消毒液（德州名德消毒科技有限公司，批號為20120202）。

動物：昆明種SPF 級ICR 小鼠40只，雄性，體質(zhì)量（18±2）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物許可證號為SCXK（滬）2012-0002號，動物環(huán)境合格證號為SYXK（蘇）2012-0037，均自由飲食。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥

分別按不同給藥方法分為4組，每組10 只。成人（按60 kg 體質(zhì)量計）每日推薦攝入量為1 050 mg，相當(dāng)于每日攝入量為17.5 mg/kg，根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（衛(wèi)生部2003）》（簡稱《規(guī)范2003》）要求，制備分別相當(dāng)于成人推薦攝入量的5 倍、10 倍和30 倍銀參膠囊［劑量為87.5，175，525 mg/（kg·d）］。稱取樣品0.875，1.750，5.250 g，加入純凈水定容至200 mL，分別作為高、中、低劑量組受試液，灌胃給藥，對照組以等體積純凈水灌胃，連續(xù)30 d。

1.2.2 對細胞免疫功能的影響

二硝基氟苯（DNFB）誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)（DTH）：在連續(xù)用藥25 d后，將各組小鼠的腹部脫毛，致敏［12］，最后取耳片、稱定質(zhì)量，計算左右耳片質(zhì)量之差作為腫脹度。

ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗（MTT 法）：連續(xù)用藥30 d后，將各組小鼠脾組織無菌取出，制備脾細胞懸液［13］。于570 nm 波長處用酶標(biāo)儀測定其光密度（A）值，以加ConA 孔與不加ConA 孔的A值的差值計算淋巴細胞的增殖能力。

1.2.3 對體液免疫功能的影響

小鼠血清溶血素測定：連續(xù)用藥30 d后，將每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（V/V）壓積綿羊紅細胞（SRBC），進行致敏［14］，計算各個樣品的半數(shù)溶血值（HC50），HC50=樣品光密度值/ SRBC 半數(shù)溶血時的光密度值×血清稀釋倍數(shù)。

抗體生成細胞（PFC）檢測（瓊脂糖平板法）：連續(xù)用藥30 d后，將每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（V/V）壓積SRBC，進行致敏［13］，分別計數(shù)各樣品溶血空斑數(shù)，用空斑數(shù)/106脾細胞表示抗體生產(chǎn)細胞數(shù)。

1.2.4 單核巨噬細胞功能測定

小鼠碳廓清實驗：連續(xù)用藥30 d后，將小鼠尾靜脈注射1∶7（V/V）印度墨汁［13］，脫臼處死，分別取肝組織和脾組織，稱定質(zhì)量，并計算吞噬指數(shù)。

小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗：小鼠連續(xù)用藥30 d后，給小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（V/V）壓積SRBC 激活小鼠的巨噬細胞，頸椎脫臼處死小鼠。分別計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)［15］。

1.2.5 自然殺傷（NK）細胞活性測定

連續(xù)用藥30 d后，將各組小鼠脾組織無菌取出，制備成脾細胞懸液，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定A值。分別計算NK細胞活性［16］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以表示，行ANOVA分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNFB 誘導(dǎo)的小鼠DTH

由表1可見，高、中、低劑量組小鼠耳廓腫脹度均高于對照組，經(jīng)方差分析及兩兩比較顯示，高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明銀參膠囊可增強DNFB誘導(dǎo)的小鼠DTH。

表1 對小鼠耳廓遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響（，mg，n=10）Tab.1 Effects on the delayed allergic reaction of auricle in mice（，mg，n=10）

表1 對小鼠耳廓遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響（，mg，n=10）Tab.1 Effects on the delayed allergic reaction of auricle in mice（，mg，n=10）

2.2 ConA 誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗（MTT 法）

由表2 可見，高、中、低劑量組與對照組光密度差值經(jīng)ANOVA 分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明銀參膠囊不具有明顯增強小鼠脾淋巴細胞增殖的能力。

表2 對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響（，n=10）Tab.2 Effects on the splenic lymphocyte transformation of mice（，n=10）

表2 對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響（，n=10）Tab.2 Effects on the splenic lymphocyte transformation of mice（，n=10）

2.3 血清溶血素測定

由表3可見，高、中、低劑量組與對照組小鼠HC50經(jīng)ANOVA 分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明銀參膠囊不具有明顯增強小鼠產(chǎn)生血清溶血素的能力。

表3 對小鼠血清溶血素水平和脾抗體生產(chǎn)細胞量的影響（，n=10）Tab.3 Effects on the serum hemolysin levels and the number of spleen antibody producing cells of mice（，n=10）

表3 對小鼠血清溶血素水平和脾抗體生產(chǎn)細胞量的影響（，n=10）Tab.3 Effects on the serum hemolysin levels and the number of spleen antibody producing cells of mice（，n=10）

2.4 PFC 檢測（瓊脂糖平板法）

由表3可見，高中低劑量組與對照組小鼠溶血空斑數(shù)經(jīng)ANOVA 分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明銀參膠囊不具有明顯增強小鼠產(chǎn)生PFC的能力。

2.5 小鼠碳廓清實驗

由表4 可見，高、中、低劑量組與對照組小鼠廓清指數(shù)及吞噬指數(shù)經(jīng)ANOVA 分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明銀參膠囊不具有明顯增強小鼠碳廓清能力的作用。

表4 對小鼠碳廓清的影響（，n=10）Tab.4 Effects on the ability of carbon clearance of mice（，n=10）

表4 對小鼠碳廓清的影響（，n=10）Tab.4 Effects on the ability of carbon clearance of mice（，n=10）

2.6 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗

由表5可知，高、中、低劑量組小鼠的巨噬細胞吞噬百分率及吞噬指數(shù)均高于對照組，經(jīng)方差分析和兩兩比較顯示，低、中、高劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明銀參膠囊具有增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的作用。

表5 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響（，n=10）Tab.5 Effects on the phagocytic ability of peritoneal macro?phages of mice（，n=10）

表5 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響（，n=10）Tab.5 Effects on the phagocytic ability of peritoneal macro?phages of mice（，n=10）

2.7 NK 細胞活性測定

由表6 可見，高、中、低劑量組小鼠的NK 細胞活性均高于對照組，方差分析及兩兩比較顯示，高劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明銀參膠囊具有增強小鼠NK細胞活性的作用。

表6 對小鼠NK細胞活性的影響（，%，n=10）Tab.6 Effects on the NK cell activity of mice（，%，n=10）

表6 對小鼠NK細胞活性的影響（，%，n=10）Tab.6 Effects on the NK cell activity of mice（，%，n=10）

3 討論

免疫是指機體識別和排除抗原性異物，維持自身生理動態(tài)平衡與相對穩(wěn)定的功能［17］。機體的免疫功能分為特異性和非特異免疫，特異性免疫又分為細胞免疫和體液免疫，非特異性免疫主要以吞噬系統(tǒng)功能為主要判斷指標(biāo)及NK 細胞功能指標(biāo)。參與細胞免疫的主要是T 淋巴細胞，其受到抗原刺激后，會轉(zhuǎn)化為致敏淋巴細胞，并表現(xiàn)出特異性免疫應(yīng)答［18］。參與體液免疫的主要是B 淋巴細胞，抗體生成細胞和血清溶血素測定是經(jīng)典的體液免疫試驗。機體參與非特異性免疫主要是吞噬細胞和NK 細胞，無需對其抗原進行識別，即可直接發(fā)揮免疫作用。

機體免疫功能低下或紊亂均可能導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，免疫調(diào)節(jié)藥物作用于免疫反應(yīng)的不同環(huán)節(jié)，具有不同的作用機制。由表1可知，與對照組比較，高劑量組小鼠耳廓腫脹度的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。銀參膠囊可增強DNFB 誘導(dǎo)的小鼠DHT 作用，在細胞免疫功能方面具有一定作用。由表3 可知，與對照組比較，高、中、低劑量組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。銀參膠囊不具有產(chǎn)生血清溶血素的能力，以及增強小鼠產(chǎn)生PFC的能力，表明銀參膠囊在體液免疫功能方面未發(fā)揮作用。由表5 和表6 可知，與對照組比較，高、中、低劑量組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。銀參膠囊可明顯增強單核-巨噬細胞的功能。

根據(jù)《規(guī)范2003》中增強免疫力功能評價標(biāo)準(zhǔn)，在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核巨噬細胞功能、NK 細胞活性4 項功能實驗中，如果有2 個功能檢測呈陽性，則可判斷樣品具有增強免疫力的作用。

綜上所述，銀參膠囊主要成分包括刺五加多糖和銀耳多糖，植物多糖作為植物的重要活性成分，對免疫調(diào)節(jié)的作用主要表現(xiàn)為免疫增強，其作用機制可能與激活巨噬細胞、激活補體系統(tǒng)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成和抗體的生成，達到影響機體的免疫功能，同時調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)，提高免疫系統(tǒng)對抗原的識別能力。但銀參膠囊增強免疫功能的具體作用機制和功效因子尚須進一步深入研究。