王晶，孟祖東，方勇，阿彩嶺，許雪

（湖北省十堰市人民醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種難治性自身免疫性疾病，涉及多個器官和系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)復雜［1］。SLE 易引起全身或局部組織和器官損傷［2］。糖皮質(zhì)激素可有效治療SLE，但長期使用會引起代謝紊亂、組織愈合延遲等不良反應(yīng)［3］。自身免疫系統(tǒng)在SLE的發(fā)病機制中非常重要，Janus 激酶（JAK）起主導作用，其異常表達或過度激活均可能導致SLE發(fā)生［4］。JAK是參與Toll樣受體（TLR）信號傳導的重要蛋白激酶，抑制JAK 信號通路有利于減少炎性級聯(lián)反應(yīng)介導的組織損傷［5］。信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）是一種氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)，STAT的異常表達已在SLE 中得到證實［6］。此外，JAK 是STAT 通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在自身免疫性疾病的發(fā)病中起重要作用［7］。生化實驗和臨床證據(jù)表明，白蒺藜皂苷具有調(diào)節(jié)免疫、控制炎癥、減少西藥副作用、降低感染發(fā)生率等作用［8-10］。本研究中探討了白蒺藜皂苷對SLE 模型小鼠免疫功能與腎功能的改善作用，以及對JAK/STAT 通路的影響，為其臨床治療提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：AU-480 型全自動生化分析儀（貝克曼庫爾特生命科學有限公司）；ZeissLSM880 型熒光顯微鏡（德國徠卡有限公司）。

試藥：醋酸潑尼松原料藥（上海施貴寶制藥有限公司，批號為MN-569696.3）；抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體、抗SM、補體C3、補體C4、24 h 尿蛋白定量（24 h pro）、血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）試劑盒（貝克曼庫爾特生命科學有限公司，批號分別為SD-48596.6，41529.5，52149.3，48972.7，89546.6，23984.3，51269.5）；10%蘇木精染色（北京索拉爾生物科技有限公司，批號為1526963）；0.5%曙紅染色（北京索拉爾生物科技有限公司，批號為5263963），Tissue-TekOCT 復合物（美國賽默飛世有限公司，批號為XD-41589.36）；0.3%Tri?tonX-100（美國Sigma 生物有限公司，批號為YU-526986.36）；異硫氰酸熒光素（FITC）偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG（1∶1 000，批號為ab23836），兔抗小鼠C3（1∶2 000，批號為ab23836），購于英國Abcam生物有限公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，中生北控生物科技有限公司，批號425969），Trizol試劑（美國Invitrogen有限公司，批號為CD-599696.65）；RevertAidTMM-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（日本Fermentas 有限公司，批號為MB-596563.36）；蛋白酶抑制劑緩沖液（美國Cell Signaling Technology 有限公司，批號為MN-658963.63）；硝酸纖維素膜（德國Schleicher&Schuell BioScience Inc 有限公司，批號為5896369）；JAK3、STAT5、GAPDH 一抗（美國SantaCruz有限公司，批號分別為CD-59693.33、XC-74856.69、KI-58741.36）；偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗（美國Cell Signaling Technology 有限公司，批號為56987.69）；增強化學發(fā)光試劑盒（ECL，美國Cell Signaling Technol?ogy 有限公司，批號為DC-574896.65）；白細胞介素2（IL -2）、腫瘤壞死因子-α（TNF -α）、白細胞介素4（IL -4）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（北京索拉爾生物科技有限公司，批號分別為B2021034、B2021095、B2021018）。

動物：12 只C57BL/ 6 小鼠，6～8 周齡，雌雄各半，體質(zhì)量（25.2±2.5）g，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2018-0035，實驗動物許可證號為SYXK（浙）2016-0158，購自西普爾可凱實驗動物有限公司。飼養(yǎng)于本院實驗中心的屏障環(huán)境（室溫20 ℃，相對濕度40%～60%，日光12 h），隔離于全封閉清潔狀態(tài)，自由飲水進食。48 只MRL/ lpr 狼瘡小鼠（MRL/ lpr 小鼠第19 號染色體Faslps 突變，可自發(fā)產(chǎn)生系統(tǒng)性免疫性自身疾病，淋巴結(jié)腫大、T 細胞增生、關(guān)節(jié)炎和免疫復合物型腎小球腎炎），6～8 周齡，體質(zhì)量（25.3±2.4）g，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2017-0005，實驗動物許可證號為SYXK（浙）2019-0012，購自上海Slac 實驗動物有限公司。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心屏障環(huán)境（室溫20 ℃，相對濕度40%～60%，日光12 h），隔離于常閉無特定病原體（SPF）狀態(tài)，自由飲水和進食。本研究已通過我院動物倫理協(xié)會批準。

1.2 方法

給藥與分組：醋酸潑尼松組（45 mg/ kg），白蒺藜皂苷低、高劑量組（100，200 mg/ kg）MRL/ lpr 狼瘡小鼠給予相應(yīng)藥物灌胃，正常對照組（C57BL/ 6 小鼠）和模型對照組小鼠灌胃等量生理鹽水，各12只，均持續(xù)8 周。

抗dsDNA、抗SM、補體C3、補體C4、24 h 尿蛋白、SCr、BUN 測定：末次治療后，所有小鼠空腹隔夜取血，靜置30 min，離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min）10 min，分離取血清，同時收集小鼠24 h 尿液；采用貝克曼AU-480 型全自動生化分析儀測定抗dsDNA、抗SM、補體C3、補體C4、24 h尿蛋白、SCr、BUN水平。

小鼠腎臟病理、熒光切片制作：腎臟在4%甲醛中固定24 h，常規(guī)脫鈣，脫水，用切片機切成5μm 厚的切片。二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟，無水乙醇水化，10%蘇木精染色，鹽酸和乙醇分化，用0.5%曙紅染色1 min，乙醇、二甲苯脫水。使用LeicaDM4000B 型光學顯微鏡觀察腎臟組織的病理變化。將速凍的腎組織用于IgG、補體C3 的免疫熒光檢查，將冷凍腎組織包埋在Tissue -TekOCT 復合物中，用4% 多聚甲醛固定30 min，用0.3%TritonX-100 透化30 min，用3%牛血清白蛋白在室溫下封閉30 min，用FITC 偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠C3 在4 ℃下孵育過夜，用DAPI 染色5 min，用熒光顯微鏡觀察染色情況。

小鼠腎臟JAK3及STAT5基因水平檢測：Trizol試劑提取腎臟中的總RNA，使用RevertAidTMM -MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，對JAK3，STAT5，GAPDH進行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT -PCR）。95 ℃預變性30 s后，將Rotor -Gene TM6000 PCR 系統(tǒng)的循環(huán)程序設(shè)置為在95 ℃下進行40次循環(huán)5 s，在56 ℃下進行30 s。當最后的循環(huán)結(jié)束時，將樣品在65 ℃保持5 s，以進一步延長。序列如下，JAK3，正向5'-TACGTAGTCGATC?GTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTCGATCGATCGATCGCT?AGT -3'，反向5' -TGTCGTAGCTAGTCGATCGTAGC?TAGCTAGCTAGCTGATCGATCGTAGCTCG-3'；STAT5，正向5'-TGCTAGTCGTAGTCGTAGCTAGTAGTCGTAGT?GTCGATCGTG -3'，反向5' -TGTGATGTAGCTGATC?GATGTCGTAGTAGTGATGTCGTACTG-3'；GAPDH，正向5' -TGTGCTGATGATGCTAGTCGTAGCTAGTCGAT?GCTAGCTGA -3'，反 向5' -TGTCGTATCGATCG?TAGCTAGTCGATCGTAGTGTAGTGTAGT -3'。每個反應(yīng)重復3 次。JAK3 和STAT5 mRNA 的相對水平分別為JAK3和STAT5吸光度與GAPDH吸光度之比。

小鼠腎臟JAK3 和STAT5 蛋白水平檢測：采用蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法測定，腎組織在蛋白酶抑制劑緩沖液中裂解并勻漿，離心（15 000g）。將提取的蛋白質(zhì)用7%凝膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS -PAGE），并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST（含0.1%Tween-20的TBS，pH 7.4）封閉后，將膜與JAK3，STAT5，GAPDH 于4 ℃溫度下過夜。洗滌后，印跡與偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗一起孵育。膜上的蛋白印跡通過ECL 試劑盒檢測。使用Quantity One（德國慕尼黑BioRad 實驗室）對測定結(jié)果進行定量。

小鼠腎組織炎性因子IL -2，TNF -α，IL -4 水平檢測：取細胞培養(yǎng)液100μL 于96 孔板內(nèi)，覆膜，37 ℃孵育2 h。棄去孔內(nèi)液體，每孔加IL-2、TNF-α、IL-4 生物素抗體工作液100μL，覆膜，37 ℃孵育1 h，棄去孔內(nèi)液體，每孔加酶結(jié)合物工作液100μL，37 ℃孵育1 h。棄去孔內(nèi)液體，洗板5 次。每孔用200 μL 的洗滌液洗滌，浸泡2 min，棄去酶標板內(nèi)的液體，在吸水紙上將酶標板拍干。每孔加入TMB 顯色底物溶液90μL，37 ℃避光孵育15～20 min。每孔加入終止液50μL，終止反應(yīng)，立即用酶標儀測量。采用ELISA法測定小鼠腎組織炎性因子IL-2，TNF-α，IL-4的水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以X±s表示，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD -t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 抗dsDNA、抗SM、補體C3、補體C4 水平

由表1可見，模型對照組小鼠抗dsDNA、抗SM 水平均顯著高于正常對照組，補體C3、補體C4 水平均顯著低于正常對照組（P<0.05）；醋酸潑尼松組，白蒺藜皂苷低、高劑量組小鼠抗dsDNA、抗SM 水平均顯著低于模型對照組，補體C3、補體C4 水平均顯著高于模型對照組（P<0.05）；隨著白蒺藜皂苷劑量的增加，白蒺藜皂苷低、高劑量組小鼠抗dsDNA、抗SM 水平逐漸降低，補體C3、補體C4水平逐漸升高（P<0.05），且上述指標水平均較醋酸潑尼松組變化顯著（P<0.05）。

表1 各組小鼠抗dsDNA、抗SM、補體C3、補體C4水平比較（，n=12）Tab.1 Comparison of anti-dsDNA，anti-SM，complement C3 and complement C4 levels of mice in each group（，n=12）

表1 各組小鼠抗dsDNA、抗SM、補體C3、補體C4水平比較（，n=12）Tab.1 Comparison of anti-dsDNA，anti-SM，complement C3 and complement C4 levels of mice in each group（，n=12）

注：與正常對照組比較，aP <0.05；與模型對照組比較，bP <0.05；與醋酸潑尼松組比較，cP <0.05；與白蒺藜皂苷低劑量組比較，dP <0.05。表2至表4同。Note：Compared with those in the normal control group，aP <0.05；Compared with those in the model control group，bP <0.05；Compared with those in the prednisone acetate group，cP <0.05；Compared with those in the STT low-dose group，dP <0.05（for Tab.1-4）.

2.2 BUN，SCr，24 h 尿蛋白水平

由表2 可見，模型對照組小鼠BUN、SCr、24 h 尿蛋白水平均顯著高于正常對照組（P<0.05）；醋酸潑尼松組，白蒺藜皂苷低、高劑量組小鼠上述指標水平均顯著低于模型對照組（P<0.05）；隨著白蒺藜皂苷劑量的增加，白蒺藜皂苷低、高劑量組小鼠上述指標水平逐漸降低（P<0.05），且顯著高于醋酸潑尼松組（P<0.05）。

表2 各組小鼠BUN、SCr、24 h尿蛋白水平比較（，n=12）Tab.2 Comparison of BUN，SCr and 24 h urinary protein levels of mice in each group（，n=12）

表2 各組小鼠BUN、SCr、24 h尿蛋白水平比較（，n=12）Tab.2 Comparison of BUN，SCr and 24 h urinary protein levels of mice in each group（，n=12）

2.3 腎組織蘇木精-伊紅（HE）染色

由圖1 可見，正常對照組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常，模型對照組小鼠腎小球體積變大，可見炎性細胞浸潤；醋酸潑尼松組，白蒺藜皂苷低、高劑量組小鼠腎小球體積變小，炎性細胞浸潤減輕。

2.4 腎組織免疫熒光染色

由圖2可見，正常對照組小鼠IgG和補體C3染色為陰性，模型對照組小鼠可見IgG 沿毛細血管袢呈不連續(xù)的顆粒樣沉積，熒光強度為++++；醋酸潑尼松組，白蒺藜皂苷低、高劑量組小鼠腎小球IgG 和補體C3 沉積情況變?nèi)酢?/p>

2.5 腎組織JAK3 及STAT5 mRNA 和蛋白水平

由表3 可見，模型對照組小鼠JAK3 及STAT5 mRNA 和蛋白水平均顯著高于正常對照組（P<0.05）；醋酸潑尼松組，白蒺藜皂苷低、高劑量組小鼠JAK3 及STAT5mRNA和蛋白水平均顯著低于模型對照組（P<0.05）；隨著白蒺藜皂苷劑量的增加，白蒺藜皂苷低、高劑量組小鼠JAK3 及STAT5 mRNA 和蛋白水平均逐漸降低（P<0.05），且均顯著高于醋酸潑尼松組（P<0.05）。各組小鼠腎組織JAK3 及STAT5 蛋白表達水平電泳圖見圖3。

表3 各組小鼠腎組織JAK3及STAT5 mRNA和蛋白水平比較（，n=12）Tab.3 Comparison of the levels of JAK3，STAT5 mRNA and pro?tein in the kidney tissue of mice in each group（，n=12）

表3 各組小鼠腎組織JAK3及STAT5 mRNA和蛋白水平比較（，n=12）Tab.3 Comparison of the levels of JAK3，STAT5 mRNA and pro?tein in the kidney tissue of mice in each group（，n=12）

2.6 腎組織炎性因子IL-2，TNF-α，IL-4 水平

由表4可見，模型對照組小鼠IL-2，TNF-α，IL-4水平均顯著高于正常對照組（P<0.05）；醋酸潑尼松組和白蒺藜皂苷低、高劑量組小鼠上述指標水平均顯著低于模型對照組（P<0.05）；隨著白蒺藜皂苷劑量的增加，白蒺藜皂苷低、高劑量組小鼠上述指標水平均逐漸降低（P<0.05），且均顯著高于醋酸潑尼松組（P<0.05）。

表4 各組小鼠腎組織炎性因子IL-2，TNF-α，IL-4水平比較（，mol/mL，n=12）Tab.4 Comparison of the inflammatory factors IL-2，TNF-α and IL-4 levels in the kidney tissue of mice in each group（，mol/mL，n=12）

表4 各組小鼠腎組織炎性因子IL-2，TNF-α，IL-4水平比較（，mol/mL，n=12）Tab.4 Comparison of the inflammatory factors IL-2，TNF-α and IL-4 levels in the kidney tissue of mice in each group（，mol/mL，n=12）

3 討論

隨著免疫抑制方案和一般醫(yī)療保健措施的改進，增殖性和膜性狼瘡性腎炎長期治療結(jié)果已無差異，但SLE患者腎炎完全緩解率仍低于12%，且40%的Ⅲ～Ⅴ期狼瘡性腎炎患者仍存在一定程度的腎功能損害［11］。即使在良好的情況下，免疫抑制劑對SLE腎炎的治療效果仍遠不能令人滿意。因此，有必要為SLE 尋找新的藥物靶點。

白蒺藜皂苷具有抗氧化、抗炎和鎮(zhèn)痛作用，肝炎、高血壓、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、惡性腫瘤等多種疾病具有潛在的治療作用［12］。白蒺藜皂苷誘導鼠和人CD4+T 淋巴細胞擴增為Foxp3+調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞，可用于緩解急性結(jié)腸炎［13］。白蒺藜皂苷還可調(diào)節(jié)外周單核細胞的活性，抑制SLE相關(guān)致病細胞因子的產(chǎn)生，如TNF-α，IL -1β，IL -12，IL -6［14］。近期的研究表明，白蒺藜皂苷能與模式識別受體如dectin-1發(fā)生潛在相互抑制作用。Dectin -1 是一種c 型凝集素，可與TLR2 協(xié)同觸發(fā)抗原呈遞細胞中的先天免疫反應(yīng)，誘導促炎作用。此外，TLR2 信號可能具有潛在增強體外和體內(nèi)Treg 細胞增殖的作用，導致Foxp3 表達的瞬時增加［15］。本研究結(jié)果顯示，模型對照組小鼠抗dsDNA、抗SM、BUN、SCr、24 h尿蛋白水平均顯著高于正常對照組，補體C3、補體C4水平均顯著低于正常對照組；醋酸潑尼松組，白蒺藜皂苷低、高劑量組小鼠抗dsDNA、抗SM、BUN、SCr、24 h 尿蛋白水平均顯著低于模型對照組，補體C3、補體C4 水平均顯著高于模型對照組。結(jié)果表明，白蒺藜皂苷能明顯抑制SLE 模型小鼠的免疫功能，并改善腎功能。由病理、熒光染色結(jié)果可知，經(jīng)醋酸潑尼松、白蒺藜皂苷治療后，各組小鼠腎小球減少，炎性細胞浸潤減輕，腎小球IgG 和補體C3 沉積情況變?nèi)?。結(jié)果表明，白蒺藜皂苷可抑制SEL模型小鼠腎臟的炎性反應(yīng)。

有研究表明，抑制JAK3可改善核因子-κB抑制因子α（IκBα）磷酸化，抑制免疫活性細胞中核因子-κB（NF-κB）信號傳導和下游促炎細胞因子產(chǎn)生，減少狼瘡相關(guān)的腎功能損傷［16］。STAT5 是一種廣泛表達的核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)各種炎性介質(zhì)中起重要作用，通常存在于細胞質(zhì)中。IKBα的磷酸化使STAT5易位到細胞核，并誘導轉(zhuǎn)錄［17］。JAK3 是SLE 發(fā)展的危險因素，JAK3 抑制劑可減弱易患狼瘡的MRL/lpr 小鼠和具有外周血單個核細胞（PBMC）的SLE 患者脾單核細胞中的NF-κB信號傳導，同時減少小鼠中促炎細胞因子的產(chǎn)生。因此，抑制JAK3 活性可能有助于發(fā)現(xiàn)SLE 和其他炎性疾病的新療法［18］。另有研究表明，脂多糖刺激MRL/lpr小鼠腹腔巨噬細胞后，炎性信號通路JAK3/ STAT5 和炎性因子TNF-α 及IL-6 的表達顯著增加［19］。這表明脂多糖與JAK 受體，特別是JAK3 的特異性結(jié)合，異常激活STAT5 信號通路，啟動免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄并誘導各種炎性反應(yīng)。在細胞試驗中，JAK3 通過shRNA 慢病毒轉(zhuǎn)染過表達，作用于MRL/ lpr 小鼠腹腔巨噬細胞，JAK3 過表達后STAT5 表達顯著增加，下游炎性分子的表達增加；而抑制JAK3 表達后，JAK3 下游分子中STAT5、IKBα、IKB 激酶（IKK）和NF-κB 的表達水平降低，磷酸化水平顯著降低［20］。IL -2，TNF -α，IL -4 是JAK3/STAT5 通路的下游因子。本研究結(jié)果顯示，模型對照組小鼠JAK3 及STAT5 mRNA 和蛋白水平均顯著高于正常對照組（P<0.05）；醋酸潑尼松組，白蒺藜皂苷低、高劑量組小鼠JAK3 及STAT5 mRNA 和蛋白水平均顯著低于模型對照組（P<0.05），且隨著白蒺藜皂苷劑量的增加，白蒺藜皂苷低、高劑量組小鼠的JAK3 及STAT5 mRNA 和蛋白水平均顯著降低（P<0.05），均顯著高于醋酸潑尼松組（P<0.05）；同時，IL-2，TNF-α，IL-4水平也被抑制。

綜上所述，白蒺藜皂苷能明顯抑制SLE模型小鼠的免疫功能，改善腎功能，其作用機制可能與白蒺藜皂苷能抑制JAK3/STAT5通路的激活有關(guān)。