袁剛，陳波濤，楊利，殷玥，石牘△

（1.重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院，重慶 400080；2.西南大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400700）

急性軟組織損傷屬中醫(yī)學(xué)“傷筋、軟傷”范疇，是常見(jiàn)的骨傷科損傷，損傷組織的出血、凝血過(guò)程，以及細(xì)胞失活介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，均可影響損傷組織的修復(fù)［1-2］。西醫(yī)采用口服或外用非甾體類抗炎藥物如外用雙氯芬酸二乙胺乳膠劑治療，可緩解炎性反應(yīng)，減輕炎性腫脹和疼痛。中醫(yī)外治法在軟組織損傷治療中占有重要地位，中藥外敷是軟組織損傷中醫(yī)外治的核心方法。中藥局部外用治療軟組織損傷臨床療效明確，可能與改善局部血液流變學(xué)指標(biāo)水平、消除代謝毒物等機(jī)制有關(guān)［3-5］。血栓素A2（TXA2）能使血小板聚集形成血栓，前列腺素I2（PGI2）是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血小板聚集抑制劑［6-7］。中藥內(nèi)服可改變TXA2和PGI2水平［1，8］。傷科傳統(tǒng)理論認(rèn)為，“肢體損于外，則氣血傷于內(nèi)”，但局部外用中藥可否改變體內(nèi)或損傷組織內(nèi)TXA2和PGI2水平尚不清楚。乾坤散是重慶中醫(yī)骨傷“儒武傷科”代表，也是重慶市九龍坡區(qū)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)“魏氏正骨”傳承至今的臨床局部外用驗(yàn)方。本研究中探討了局部外用乾坤散對(duì)急性軟組織損傷模型大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)、TXA2及PGI2水平的影響，為中藥“外治內(nèi)應(yīng)”機(jī)理的研究提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：SZ810 型連續(xù)變倍體式顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；SMZ -B4 型微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器有限公司）；WH-2 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）；EL204 型酶標(biāo)儀（基因科技<上海>股份有限公司）；ELX800 型雪花機(jī)（美國(guó)Grant公司）；XB70型掌式離心機(jī)（其林貝爾儀器制造有限公司）；LX -100 型移液槍（德國(guó)Eppendorf 公司）；MVIS-2045 型全自動(dòng)血液流變分析儀（重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司）；BC-5180 型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

試藥：乾坤散（重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院醫(yī)院制劑），由生川烏、當(dāng)歸、白芷、生南星、梔子、甲珠、生大黃、瓦楞子、生黃柏、三七、乳香、沒(méi)藥、橘絡(luò)、紅花等組方，按處方比例混合打粉，過(guò)120 目篩，凡士林、熱水、藥粉質(zhì)量比為0.5∶2∶1；雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（北京諾華制藥有限公司，批號(hào)為H19990291）；水合氯醛（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)為2019121301）；大鼠PGI2酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)為YX -160705R），大鼠TXA2ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)為YX -202401R），均購(gòu)自上海優(yōu)選生物科技有限公司。

動(dòng)物：SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（湘）2019 -0004，動(dòng)物合格證號(hào)為NO.430727200101466125，于西南大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為20～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～60%，12 h/12 h明暗交替。大鼠的飼養(yǎng)和使用均符合我國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，本實(shí)驗(yàn)獲得西南大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)為yxy202102。

1.2 方法

造模、分組與給藥：將SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，于造模前24 h 用脫毛膏除去右后肢腿毛。按隨機(jī)數(shù)字表法抽取10 只大鼠為空白組，其余50 只大鼠采用砸傷法復(fù)制急性軟組織損傷模型［5，9］。腹腔注射3.5%水合氯醛（1 mL/ 100 g）麻醉，將兩層薄紗片覆蓋于大鼠右大腿中上1/3 內(nèi)側(cè)肌肉豐厚處，采用質(zhì)量為200 g 的實(shí)心球從60 cm 高度塑料圓筒內(nèi)垂直自由落下，實(shí)心球與大鼠肌肉接觸面積為2 cm × 2 cm，連續(xù)10 次。參考文獻(xiàn)［9 -10］判斷造模是否成功。50 只大鼠均造模成功，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，雙氯芬酸組（4×10-5g/cm2），乾坤散低、中、高劑量組（0.15，0.30，0.60 g/ cm2），除模型組大鼠外，其余各組大鼠造模2 h后，將對(duì)應(yīng)藥物貼敷于患處，每天2次，連續(xù)7 d。

軟組織急性損傷評(píng)分：評(píng)估造模后24 h、造模后7 d 的腫脹情況，計(jì)算軟組織急性損傷評(píng)分［9］。1）皮下瘀血。瘀斑計(jì)2分；點(diǎn)狀瘀血計(jì)1分；無(wú)瘀血計(jì)0分。2）腫脹程度。皮尺測(cè)量大鼠雙側(cè)大腿中上1/3 處腿圍，比較腫脹程度。明顯腫脹計(jì)2 分；輕微腫脹計(jì)1 分；無(wú)腫脹計(jì)0 分。3）皮膚顏色。瘀暗色深計(jì)2 分；瘀暗色淺計(jì)1 分；正常計(jì)0 分。4）肢體活動(dòng)。跛行伴活動(dòng)受限計(jì)2 分；傷肢動(dòng)作遲緩，但活動(dòng)無(wú)明顯受限計(jì)1 分；活動(dòng)正常計(jì)0 分。評(píng)分時(shí)掩蔽分組信息，由3名研究者評(píng)分，取平均值。

病理組織學(xué)檢查：造模后7 d，麻醉大鼠，處死取損傷部位肌肉組織，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色觀察軟組織損傷病理形態(tài)，并進(jìn)行組織學(xué)修復(fù)評(píng)級(jí)［11］。軟組織基本恢復(fù)至正常水平，為0級(jí)（優(yōu)）；肌肉組織水腫、瘀血癥狀大部分消失，增生血管和膠原纖維數(shù)量基本恢復(fù)，為1級(jí)（良）；肌纖維腫脹且伴有變性，肌肉組織水腫、瘀血、出血灶稍減輕或部分消失，纖維母細(xì)胞浸入，血管增生或膠原纖維增生，為2 級(jí)（可）；肌纖維腫脹伴透明變性或明顯壞死伴水腫、出血、嚴(yán)重瘀血，為3級(jí)（差）。

血液流變學(xué)指標(biāo)及TXA2和PGI2水平測(cè)定：分別于造模前、造模后24 h 和造模后7 d 行股動(dòng)脈采血，采用MVIS-2045 型全自動(dòng)血液流變分析儀測(cè)定全血黏度、全血低切黏度、全血高切黏度，并計(jì)算紅細(xì)胞聚集指數(shù)；采用ELISA 法測(cè)定TXA2和PGI2的水平，并計(jì)算TXA2/PGI2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS Statistics 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，行Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。計(jì)量資料以表示，行Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；兩兩比較采用Bonferroni法；組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟組織急性損傷評(píng)分

造模后7 d，與模型組比較，雙氯芬酸組和乾坤散低、中、高劑量組大鼠的軟組織急性損傷評(píng)分均顯著降低（P<0.05）；與乾坤散低劑量組比較，乾坤散高劑量組大鼠的軟組織急性損傷評(píng)分顯著降低（P<0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠軟組織急性損傷評(píng)分比較（，分，n=10）Tab.1 Comparison of scores of acute soft tissue injury of rats in each group（，point，n=10）

表1 各組大鼠軟組織急性損傷評(píng)分比較（，分，n=10）Tab.1 Comparison of scores of acute soft tissue injury of rats in each group（，point，n=10）

注：與模型組比較，△P <0.05；與乾坤散低劑量組比較，*P <0.05。Note：Compared with those in the model group，△P <0.05；Com?pared with those in the Qiankun Powder low -dose group，*P <0.05.

2.2 病理組織學(xué)檢查結(jié)果

造模后7 d，各組大鼠軟組織急性損傷病理形態(tài)見(jiàn)圖1?？芍?，空白組大鼠肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常；模型組大鼠肌纖維斷裂嚴(yán)重，肌間隙淤血滲出，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；雙氯芬組大鼠肌纖維排列較整齊，結(jié)構(gòu)形態(tài)接近正常；乾坤散低、中、高劑量組大鼠局部肌纖維斷裂，肌間隙瘀血滲出、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。

造模后7 d，各組大鼠組織學(xué)修復(fù)評(píng)級(jí)結(jié)果見(jiàn)表2?？芍?，與空白組比較，模型組大鼠組織學(xué)修復(fù)評(píng)級(jí)為優(yōu)和良的總比例顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，雙氯芬組和乾坤散高劑量組大鼠組織學(xué)修復(fù)評(píng)級(jí)為優(yōu)和良的總比例均顯著升高（P<0.05）。

表2 各組大鼠造模后7 d組織學(xué)修復(fù)評(píng)級(jí)結(jié)果比較［只（%），n=10］Tab.2 Comparison of histological repair rating of rats in each group after 7 d of modeling［rat（%），n=10］

2.3 血液流變學(xué)指標(biāo)

與空白組比較，造模后24 h 模型組大鼠的血漿黏度、全血低切黏度、全血高切黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，造模后7 d，雙氯芬酸組和乾坤散低、中、高劑量組大鼠的全血低切黏度、全血高切黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均顯著降低（P<0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較（，n=10）Tab.3 Comparison of hemorheological indexes of rats in each group（，n=10）

表3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較（，n=10）Tab.3 Comparison of hemorheological indexes of rats in each group（，n=10）

2.4 TXA2 和PGI2 水平及TXA2/PGI2

造模后24 h 及造模后7 d，與模型組比較，乾坤散低、中、高劑量組大鼠的TXA2和PGI2水平均無(wú)顯著差異（P>0.05）。造模前各組大鼠TXA2/PGI2為0.98～1.01；造模后24 h，模型組和雙氯芬酸組大鼠的TXA2/PGI2均偏離1.0，乾坤散低、中、高劑量組大鼠的TXA2/PGI2均接近1.0；造模后7 d，乾坤散低、中、高劑量組大鼠的TXA2/PGI2均接近1.0。詳見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠急性損傷組織中TXA2和PGI2比較（，n=10）Tab.4 Comparison of TXA2 and PGI2 in acute injured tissues of rats in each group（，n=10）

表4 各組大鼠急性損傷組織中TXA2和PGI2比較（，n=10）Tab.4 Comparison of TXA2 and PGI2 in acute injured tissues of rats in each group（，n=10）

3 討論

軟組織損傷導(dǎo)致受損組織中的血管活性物質(zhì)、前列腺素等炎性介質(zhì)和酸性產(chǎn)物積聚，誘導(dǎo)損傷部位發(fā)生一系列微循環(huán)改變，包括毛細(xì)血管通透性增加、血流緩慢，嚴(yán)重血流淤積甚至閉塞，反復(fù)疊加，形成惡性循環(huán)［12］。西醫(yī)通常采取休息，支具或石膏制動(dòng)，冷敷，口服非甾體抗炎藥治療［1，13-15］。中醫(yī)認(rèn)為，各種膏、丹、丸散及湯藥熏、蒸、泡、浴均可起到“外治內(nèi)應(yīng)”“外用內(nèi)效”的作用；中藥貼敷治療軟組織損傷臨床應(yīng)用廣泛，可改善局部血流特性，消除代謝毒物。TXA2和PGI2是血小板聚集和抑制的一對(duì)標(biāo)志物，外用中藥可否改變損傷組織內(nèi)的TXA2和PGI2水平尚未明確［6-7］。

本研究中，乾坤散外用貼敷可改善模型大鼠的軟組織急性損傷評(píng)分和病理形態(tài)；且與模型組大鼠比較，造模后7 d，乾坤散高劑量組大鼠的組織學(xué)修復(fù)評(píng)級(jí)為優(yōu)和良的總比例顯著升高（P<0.05），乾坤散低、中、高劑量組大鼠的全血低切黏度、全血高切黏度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)均顯著降低（P<0.05），推測(cè)乾坤散貼敷損傷局部可改善損傷組織的微循環(huán)，調(diào)節(jié)血液黏度，從而發(fā)揮“外治內(nèi)應(yīng)”的作用。雙氯芬酸二乙胺乳膠劑是經(jīng)典的非甾體類外用鎮(zhèn)痛劑，為前列腺素合成抑制劑，具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用。局部應(yīng)用時(shí)，其有效成分可穿透皮膚到達(dá)炎性區(qū)域，緩解急、慢性炎性反應(yīng)，減輕炎性腫脹程度，緩解疼痛。本研究中，乾坤散低、中、高劑量組大鼠軟組織急性損傷評(píng)分和病理學(xué)表現(xiàn)與雙氯芬酸組大鼠均接近，提示乾坤散可能存在抑制炎性組織滲出、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的作用。

TXA2由血小板微粒體合成與釋放，具有較強(qiáng)的血小板聚集能力，可導(dǎo)致血栓形成；PGI2由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，擴(kuò)張血管作用強(qiáng)烈，可抑制血小板聚集［6-7］。本研究中，空白組大鼠的TXA2/PGI2為1.0，造模后24 h，模型組大鼠的TXA2和PGI2水平均升高，且模型組和雙氯芬組大鼠的TXA2/ PGI2均失衡，乾坤散低、中、高劑量組大鼠的TXA2/PGI2仍維持較好的平衡狀態(tài)；造模后7 d，模型組和乾坤散各劑量組大鼠的TXA2和PGI2水平逐漸降至造模前，但雙氯芬酸組大鼠的PGI2水平明顯下降，導(dǎo)致TXA2/ PGI2失衡。推測(cè)體內(nèi)血凝狀態(tài)通過(guò)TXA2/ PGI2的平衡進(jìn)行調(diào)節(jié)。雖然雙氯芬組和乾坤散高、中、低劑量組大鼠的療效評(píng)價(jià)相近，但作用機(jī)制不同，雙氯芬酸二乙胺乳膠劑主要通過(guò)抑制PGI2合成而發(fā)揮作用，與雙氯芬組相比，乾坤散能更快地調(diào)節(jié)TXA2/PGI2平衡，可能是實(shí)現(xiàn)中藥貼敷“外治內(nèi)應(yīng)”、促進(jìn)微循環(huán)改善的重要作用機(jī)制。

乾坤散方中，當(dāng)歸、紅花、乳香、沒(méi)藥、三七活血散瘀，瘀去新生；橘絡(luò)行氣，使氣行血活；梔子、大黃、黃柏清熱涼血，消腫；甲珠通經(jīng)絡(luò)，消腫；瓦楞子軟堅(jiān)散結(jié)，消腫。諸藥合用，起到散瘀活血、通絡(luò)軟堅(jiān)、消腫止痛的功效。推測(cè)局部外用乾坤散治療急性軟組織損傷可能通過(guò)改善損傷組織的微循環(huán)、機(jī)體血液黏度，調(diào)節(jié)血小板聚集，抑制損傷組織的炎性反應(yīng)而發(fā)揮作用，這可能是傷科“肢體損于外，氣血傷于內(nèi)”機(jī)制和中藥貼敷“外治內(nèi)應(yīng)”的理論基礎(chǔ)之一。

綜上所述，局部外用乾坤散可改善急性軟組織損傷模型大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)，調(diào)節(jié)TXA2/PGI2平衡，改善損傷組織的微循環(huán)，實(shí)現(xiàn)中藥貼敷治療的“外治內(nèi)應(yīng)”效應(yīng)。