◎ 程艷薇，張蓓林，田時雨，王雪酈，譚書明

（1.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 食品與藥品系，貴州 貴陽 551400；2.貴州建設(shè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 清鎮(zhèn) 551499；3.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025;4.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

泡椒是我國川滇黔地區(qū)的傳統(tǒng)特色美食，采用發(fā)酵工藝制作，民間也稱之為“魚辣子”。其制作工藝簡單，具體工藝流程為新鮮辣椒采摘后先清洗干凈，再放入鹽水中泡制，在多種微生物的共同發(fā)酵下最終得到成品泡菜產(chǎn)品。其具有酸辣可口、風(fēng)味鮮香、營養(yǎng)豐富和刺激食欲的特點(diǎn)，能改善腸道環(huán)境、健胃消食、預(yù)防風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[1]。近年來，隨著“康師傅”“統(tǒng)一”等眾多的食品企業(yè)采用泡椒作為重要原料，住宿及餐飲行業(yè)均使用泡椒來制作“泡椒鳳爪”，其需求量持續(xù)增加，僅在2016年一年時間里，泡椒鳳爪在國內(nèi)市場的銷售量就達(dá)到了2.26億袋[2]。目前，貴州作為辣椒的主要產(chǎn)區(qū)，辣椒加工在全國也名列前茅，其中泡椒是貴州辣椒加工產(chǎn)品中的第二大類產(chǎn)品，全省年產(chǎn)量有30萬t左右。泡椒因其酸辣可口的口感和突出的營養(yǎng)保健功效，深受人們的喜愛[1]。但當(dāng)前泡椒大多采用傳統(tǒng)工藝自然發(fā)酵而成，存在規(guī)模小、脆度低、勞動強(qiáng)度大、操作煩瑣和產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。針對以上問題，本研究從優(yōu)質(zhì)的泡椒中分離優(yōu)良菌株，進(jìn)行鑒定到種，并篩選出抗逆性優(yōu)良、產(chǎn)品脆度高的優(yōu)勢菌株，經(jīng)噴霧干燥為菌粉后直投式發(fā)酵。通過驗(yàn)證，新工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量口感等方面優(yōu)于傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量，為我國泡菜工藝發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1號和2號樣品為貴州省石阡和記綠色食品開發(fā)有限公司提供的泡椒；3號和4號樣品為菜場出售的當(dāng)?shù)嘏萁分破罚?號為CICC直投式泡菜發(fā)酵復(fù)合菌粉：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院菌種保藏中心研制。

嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）、干酪乳桿菌 （L. casei）和鼠李乳桿菌（L. rhamnosus）3種純化凍干菌種，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品選擇方法

以口感較好為選擇標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品的選擇，利于篩選出優(yōu)質(zhì)的菌株。

1.2.2 菌株分離方法

（1）按照培養(yǎng)基配方配制MRS瓊脂培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至6.2～6.4，于121 ℃滅菌20 min后，置于無菌操作臺上冷卻備用。

（2）稱取辣椒固液混合樣品10 g，分別放入內(nèi)裝90 mL無菌生理鹽水且內(nèi)有玻璃珠的三角瓶中，振搖約20 min，使辣椒樣品與水充分混合，將細(xì)胞分散。吸取1 mL泡椒懸濁液加入9 mL無菌生理鹽水的試管中，混合均勻，并制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7共7種不同稀釋度的泡椒溶液以備用。

（3）取10個滅菌的培養(yǎng)皿，取其中一個平板加入0.3 mL滅菌水，作為空白對照。剩余9個平板平均分為3組，分別取10-5、10-6、10-7這3個梯度的溶液 0.3 mL注入平板中，做好標(biāo)記。將滅菌后MRS瓊脂培養(yǎng)基冷卻至45 ℃時，注入培養(yǎng)皿中約15 mL，并轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻。

（4）待培養(yǎng)基冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，至37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。

（5）將培養(yǎng)后的平板取出，觀察其菌落形態(tài)。選取具有不同菌落形態(tài)的單個菌落，進(jìn)行編號，分別挑取少許細(xì)胞用劃線法接種到MRS培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)。最后將分離后的菌接種到斜面上保存（試管用雙層保鮮袋密封培養(yǎng)）[3]。

1.3 分析方法

菌種生產(chǎn)能力測定：產(chǎn)酸檢測方法參照《乳酸菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》[4]；還原糖分解速率檢測方法參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測定》 （GB/T 5009.7—2016）。

菌種抗逆能力測定：菌種耐酸性參照吳潔[3]的方法檢測；光電比濁法測量細(xì)菌數(shù)量參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》檢測[5]；菌種耐鹽性能測定參照《微生物實(shí)驗(yàn)》檢測[6]；細(xì)菌素檢驗(yàn)參照周俊良[7]的方法檢測；分解果膠能力實(shí)驗(yàn)參照《水果及其制品中果膠含量的測定 分光光度法》（NY/T 2016—2011）檢測。

泡椒成品的檢測：還原糖含量參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中還原糖的測定》（GB/T 5009.7—2016）檢測；總酸參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》（GB 12456—2021）檢測；可溶性固形物含量參照《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定 折射儀法》（NY/T 2637—2014）檢測；鹽分參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氯化物的測定》（GB 5009.44—2016）檢測；亞硝酸鹽含量參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）檢測；吲哚和硫化氫參照黃君紅等[8]的方法檢測；砷參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無機(jī)砷的測定》 （GB 5009.11—2014）檢測；汞參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總汞及有機(jī)汞的測定》（GB 5009.17—2021）檢測；菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)、大腸桿菌數(shù)、金黃色葡萄球菌數(shù)和沙門氏菌參照《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 調(diào)味品檢驗(yàn)》（GB/T 4789.22—2003）檢測；黃曲霉毒素參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分類鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果

從5份樣品中共分離純化得到乳酸桿菌32株，根據(jù)來源進(jìn)行編號為1-L1、1-L2、1-L3、1-L4、1-L5、1-L6、1-L7、2-L1、2-L2、2-L3、2-L4、2-L5、3-L1、3-L2、3-L3、3-L4、3-L5、4-L1、4-L2、4-L3、4-L4、4-L5、4-L6、4-L7、4-L8、4-L9、4-L10、5-L1、5-L2、5-L3、5-L4和5-L5。分別使用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，使用雙層袋對培養(yǎng)皿進(jìn)行密封后，放置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后分別觀察菌落特征，并同時對分離純化菌種進(jìn)行挑菌涂片，后進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。結(jié)果 見表1。

表1 乳酸桿菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表

進(jìn)一步通過形態(tài)學(xué)鑒定，初步確定6株乳酸菌，從其相同形態(tài)的菌株中任取一株菌進(jìn)行純化用于進(jìn)一步的生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定。其基本性質(zhì)如表2所示。

表2 乳酸桿菌生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.1.2 不同菌株生理生化檢驗(yàn)結(jié)果

不同菌株的菌體形態(tài)特征和生態(tài)學(xué)特性表明以上6株乳酸菌為乳桿菌屬。而乳桿菌種的劃分主要根據(jù)碳水化合物的發(fā)酵情況，根據(jù)表3中的結(jié)果，對照“乳桿菌屬內(nèi)專性同型發(fā)酵的種的生理生化特征表”[9]，6株乳酸菌的擬鑒定結(jié)果如表4所示。

2.2 菌種分析

2.2.1 產(chǎn)酸能力檢測

泡椒是經(jīng)自然乳酸發(fā)酵制作的辣椒產(chǎn)品，酸度不僅起到調(diào)味的作用，高酸度還可以增加產(chǎn)品的保藏性。各菌種的產(chǎn)酸能力如圖1所示，5-L4、干酪乳桿菌、鼠李乳桿菌和1-L2這4株乳酸桿菌產(chǎn)酸性能較強(qiáng)，其中鼠李乳桿菌產(chǎn)酸性能最強(qiáng)。

表3 乳酸桿菌生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表4 菌株擬鑒定結(jié)果表

圖1 乳酸菌產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)折線圖

圖2 乳酸菌耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析圖

2.2.2 還原糖分解效率檢測

還原糖分解效率對于泡椒產(chǎn)品質(zhì)量而言十分重要，通過對各菌種的還原糖分解效率進(jìn)行檢測，其結(jié)果見表5。1-L7、2-L4、1-L1所耗還原糖相對較慢，消耗還原糖較快的為3-L5、5-L4、干酪乳桿菌、鼠李乳桿菌和嗜酸乳桿菌，而1-L2菌液樣品中的還原糖耗量最快，在培養(yǎng)48 h時培養(yǎng)皿中的還原糖已基本耗盡，故3-L5、5-L4、干酪乳桿菌、鼠李乳桿菌、嗜酸乳桿菌和1-L2為相對耗糖速率較快的優(yōu)勢菌株。

表5 48 h還原糖的消耗率表（單位：g/100 mL）

2.2.3 耐酸性檢測

優(yōu)良的乳酸菌株不僅產(chǎn)酸性強(qiáng)，抗逆性也較好，菌株的耐酸性與菌株的產(chǎn)酸量能力有很大關(guān)系，一般情況下，耐酸性好的菌株最終的產(chǎn)酸量也較大，故發(fā)酵菌株對酸度的耐受性也是選擇菌株的一個重要指標(biāo)[4]。隨著發(fā)酵過程中pH值降低，菌株生長會受到抑制，整體的產(chǎn)酸速度就會隨之下降，故通過耐酸實(shí)驗(yàn)，能篩選出產(chǎn)酸能力強(qiáng)、耐酸性能較好的優(yōu)良發(fā)酵菌株。

各菌株的耐酸能力如圖2所示，1-L2、3-L5和鼠李乳桿菌耐酸性較強(qiáng)，在pH為2.0時仍生長良好，2-L4、1-L7、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和1-L1的耐酸性能稍弱一些，在pH為3.5情況下仍能正常生長。但當(dāng)pH降低到2.0時，5-L4的OD值則出現(xiàn)了特殊情況，其數(shù)值為負(fù)值，即比空白實(shí)驗(yàn)低，這是由菌種在這種狀態(tài)下大量死亡、細(xì)胞裂解自溶所造成的。

2.2.4 耐鹽能力檢測

在發(fā)酵過程中，食鹽不僅有調(diào)味的作用還有防腐的功效，因此發(fā)酵菌株對鹽濃度的抗逆性也是菌株選擇的一個重要指標(biāo)[6]。對這9株乳酸菌分別進(jìn)行了耐鹽性測定，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著鹽濃度的不斷增加，OD值逐漸降低，但幾乎所有被測菌株在食鹽培養(yǎng)基中仍能緩慢生長；5-L4、2-L4、干酪乳桿菌和鼠李乳桿菌還表現(xiàn)出了嗜鹽性。目前市場上所銷售的發(fā)酵辣椒制品中，食鹽含量通常在7%～l0%，而口感相對較好的泡椒其食鹽含量在7%～8%，檢測結(jié)果證實(shí)，在耐鹽性上被測9株菌均能達(dá)到市售商品的要求。

2.2.5 細(xì)菌素生產(chǎn)能力檢測

細(xì)菌素是細(xì)菌在其代謝過程中合成并分泌到周圍環(huán)境中的一類有抑菌作用的蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，乳酸菌代謝也可以產(chǎn)生此類物質(zhì)，由此乳酸菌在泡椒中可以改善產(chǎn)品的組織狀態(tài)和風(fēng)味，其產(chǎn)生的細(xì)菌素還有防腐抑菌的效果[10]。故細(xì)菌素的生產(chǎn)能力對優(yōu)化菌種、提高生產(chǎn)效率具有重要意義，因而本實(shí)驗(yàn)研究了9株乳酸菌的細(xì)菌素生產(chǎn)能力，并從其中篩選出細(xì)菌素生產(chǎn)能力強(qiáng)的菌株，為提高泡椒食品安全性提供數(shù)據(jù)支持。本實(shí)驗(yàn)對9株乳酸菌采用牛津杯法測定其產(chǎn)細(xì)菌素能力，其檢測結(jié)果表6所示。

圖3 不同鹽濃度培養(yǎng)前后OD差值圖

表6 細(xì)菌素生產(chǎn)能力比較測定結(jié)果表

由表6可知，9株乳酸菌中有7株分泌細(xì)菌素，但分泌的細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的抑制作用卻各不相同。其中對3種有害菌都有抑菌作用的是3-L5、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李乳桿菌；而1-L2只對大腸桿菌有抑制作用，對其他兩種都沒有抑制作用。

2.2.6 果膠分解能力檢測

剩余果膠含量與乳酸菌分解果膠的能力成反比，因此從圖4中可以看出，3-L5、嗜酸乳桿菌和鼠李乳桿菌分解果膠的能力弱，干酪、2-L4、1-L1分解果膠的能力最強(qiáng)，1-L7、1-L2、5-L4分解果膠的能力較弱，最弱的是嗜酸乳桿菌。

2.2.7 乳酸桿菌綜合能力比較

對9株乳桿菌的綜合性能比較見表7。由表7可知，綜合評分較高菌株前三分別為鼠李乳桿菌15分，3-L5 10分，干酪乳桿菌9分，之后為1-L2、5-L4、2-L4和嗜酸乳桿菌。為最大限度保證產(chǎn)品的脆度，經(jīng)綜合分析選用3-L5（食果糖乳桿菌）、嗜酸乳桿菌和鼠李乳桿菌為最終發(fā)酵菌種。

圖4 乳桿菌分解果膠后剩余果膠含量圖

表7 乳酸桿菌的綜合性能比較表

2.3 改良菌種發(fā)酵質(zhì)量評價

為驗(yàn)證選育菌種實(shí)際加工生產(chǎn)能力，將已分離純化的優(yōu)勢菌株食果糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李乳桿菌按比例為1∶2∶1（質(zhì)量比）進(jìn)行配比，在進(jìn)口溫度為170 ℃，β-環(huán)糊精的添加量為2.5%，流速為50 m3·h-1的條件下噴霧干燥成復(fù)合發(fā)酵劑菌粉，然后采用直投式發(fā)酵泡椒，其成品與傳統(tǒng)工藝加工的泡椒進(jìn)行比較。

2.3.1 感官指標(biāo)比較

參照《食品分析與感觀評定》的相關(guān)評定方法，隨機(jī)抽取15名食品專業(yè)學(xué)生，分為3小組，按色澤（25分）、 口感（25分）、風(fēng)味（25分）和咀嚼感（25分）進(jìn)行評分，評分結(jié)果見表8。

從表8可以看出，在色澤和咀嚼感兩個指標(biāo)上，采用改良型復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵的泡椒效果顯然比自然乳酸發(fā)酵的泡椒要好，這說明直投式復(fù)合型發(fā)酵劑中不存在產(chǎn)不良色素的微生物，且發(fā)酵微生物對發(fā)酵底物的利用合理，直投式復(fù)合型發(fā)酵劑發(fā)酵的辣椒大大提高了產(chǎn)品的脆度[11]；在風(fēng)味和口感上，改良型復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵的泡椒質(zhì)量與自然工藝發(fā)酵的泡椒類似，說明改良后的新工藝從各個方面都有一定的提高，完全滿足目前市場上對于泡椒的口感需求。

表8 泡椒感官評分標(biāo)準(zhǔn)表（單位：分）

2.3.2 理化指標(biāo)比較

從表9可知，還原糖含量方面，通過改良工藝發(fā)酵的泡椒還原糖含量比傳統(tǒng)自然發(fā)酵法制作的泡椒低，總酸和可溶性固形物的含量相對較高，說明乳酸菌在改良后的新工藝環(huán)境中能更好地生長。亞硝酸鹽含量上，改良后的新工藝所含亞硝酸鹽的含量低于傳統(tǒng)自然發(fā)酵工藝制作的泡椒，說明改良后的新工藝制作的泡椒更加安全。

表9 成品各指標(biāo)檢測結(jié)果對比表

2.4 泡椒成品指標(biāo)

泡椒在發(fā)酵過程中，可能伴隨著工藝要求和發(fā)酵過程產(chǎn)生某些影響人體健康的物質(zhì)。食鹽含量的高低決定著泡椒的風(fēng)味和口感，同時過高的含鹽量會危害人體健康[12]。部分泡椒中的金屬毒素也會導(dǎo)致人體重金屬慢性中毒，泡椒中原料和添加劑中的砷也有可能會在泡椒發(fā)酵過程中積累，從而危害人體健康[13-14]。而發(fā)酵工藝不當(dāng)、溫度過低都會導(dǎo)致微生物大量繁殖，從而產(chǎn)生微生物毒素，影響人體健康[15-16]。因此，對采用改良型復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵的泡椒進(jìn)行各項(xiàng)規(guī)定指標(biāo)的檢測，結(jié)果如表10所示。結(jié)果表明，泡椒各項(xiàng)指標(biāo)均符合國家規(guī)定出廠要求，從安全性角度說明采用課題組改良型復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵的泡椒完全達(dá)到食品安全質(zhì)量要求。

表10 成品各指標(biāo)檢測結(jié)果表

3 結(jié)論

泡椒成熟過程中，乳酸桿菌為優(yōu)勢菌群。乳酸菌的迅速生長、pH的迅速下降是乳酸發(fā)酵優(yōu)質(zhì)辣椒的關(guān)鍵。隨著時間的延長，鹽腌法制作的泡椒產(chǎn)品pH變化緩慢，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，辣椒的脆度明顯下降，質(zhì)地漸漸變軟。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究從優(yōu)質(zhì)的泡椒中篩選出產(chǎn)酸能力強(qiáng)、耐鹽性較強(qiáng)、產(chǎn)細(xì)菌素能力較強(qiáng)以及分解果膠能力弱的優(yōu)勢菌株食果糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李乳桿菌，經(jīng)驗(yàn)證優(yōu)勢菌株發(fā)酵的泡椒質(zhì)量優(yōu)于傳統(tǒng)泡椒。