韓東，杜霞，李林林，劉金華，彭修娟，張鑫，龔偉玲，李波，劉峰，，6*（1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 7106；.陜西國際商貿學院，陜西 咸陽 7106；.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 71000；.保定天浩制藥有限公司，河北 保定 0760；.陜西步長制藥有限公司，西安 71007；6.陜西省中藥綠色制造技術協(xié)同創(chuàng)新中心，西安 71007）

肝爽顆粒是由黨參、柴胡（醋制）、白芍、當歸、茯苓、白術（炒）、枳殼（炒）、蒲公英、虎杖、夏枯草、丹參、桃仁、鱉甲（燙）組成的中藥復方制劑，具有疏肝健脾、清熱散淤、保肝護肝、軟堅散結的作用，臨床上已經被用于治療各種慢性肝臟疾病[1-4]。

近些年來，中草藥受到世界各國的廣泛關注，中國有出口的中藥材近500 種，中成藥2000多種，全球藥用植物的消費額約140 億美元，預計到2050年將增至5 萬億美元[5]。隨著中藥材的蓬勃發(fā)展，人們越來越重視其質量和安全。重金屬等有害元素在藥材體內富集蓄積情況普遍，影響人體健康，也引起大量關注[6]。與此同時，隨著現(xiàn)代藥物分析對中藥制劑研究的不斷深入，人們不僅對中藥制劑有機成分進行了詳細研究，無機元素所發(fā)揮的作用也越來越受到關注[7]。

目前測定重金屬元素的方法有很多，如原子熒光分光光譜法[8]、原子吸收分光光譜法[9]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[10]等，其中，電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）具有極低的檢測限、線性動態(tài)范圍寬、靈敏度高、準確、分析速度快等特點，已經用于多種中成藥的無機元素分析[11-15]。因此本試驗采用微波消解ICP-MS 法對肝爽顆粒中無機元素進行測定，并且采用聚類分析法和主成分分析法（PCA）對無機元素進行分析，明確肝爽顆粒的特征無機元素，以期從無機元素層面評估肝爽顆粒的質量均一性和安全性。

1 材料

1.1 儀器

Muiti Wav PRO 41HVT56 微波消解儀[安東帕（美國）有限公司]；TE124S 電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；Milli-Q Reference 超純水儀[默克化工技術（上海）有限公司]；ICAP RQ ICP-MS 電感耦合等離子體質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 試藥

銦（In）單元素標準溶液（批號：203044-2）、汞（Hg）單元素標準溶液（批號：207031-1）[1000 μg·mL－1，國標（北京）檢驗認證有限公司]；鍺（Ge）單元素標準溶液（1000 μg·mL－1，批號：207002）、混合標準溶液[含鋁（Al）、砷（As）、硼（B）、鋇（Ba）、鈣（Ca）、鎘（Cd）、鈷（Co）、鉻（Cr）、銅（Cu）、鐵（Fe）、鉀（K）、鎂（Mg）、錳（Mn）、鉬（Mo）、鈉（Na）、鎳（Ni）、鉛（Pb）、銻（Sb）、硒（Se）、錫（Sn）、鍶（Sr）、鈦（Ti）、鉈（Tl）、釩（V）、鋅（Zn），均為100 μg·mL－1，批號：20DB390]（國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；硝酸（HNO3，質量分數(shù)為65%），水為超純水（Milli-Q 制水系統(tǒng)制得）。肝爽顆粒（保定天浩制藥有限公司，批號：200814、200815、200816、201215、201216、201217、201218、201219、201220、201221， 編號：S1 ～S10，規(guī)格：每袋3 g）。

2 方法與結果

2.1 標準品溶液的制備

精密移取適量的混合標準品溶液，用10% HNO3溶液稀釋，制成質量濃度為1 μg·mL－1的標準品儲備液，再用2%HNO3溶液依次稀釋，配制成含Na、B、Mg、Al、Ti、K、Cr、Ca、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Sr、Sn、Cd、Sb、Ba、Tl、Pb 分別為0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、25.0、50.0、75.0、100.0、125.0、150.0、175.0、200.0、250.0、500.0、750.0、1000、2000、5000 μg·L－1的標準品溶液。精密移取適量的Hg 單元素標準溶液，用10% HNO3溶液稀釋成0.5 μg·mL－1的溶液，作為Hg 的標準儲備液，精密移取Hg 的標準儲備液，用2% HNO3溶液稀釋，制成質量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5 ng·mL－1的標準品溶液（臨用時現(xiàn)配）。

2.2 內標溶液的制備

分別精密移取適量的Ge 和In 單元素標準溶液，用10% HNO3稀釋成1 μg·mL－1的混合內標儲備液。精密移取混合內標儲備液，用2%HNO3溶液稀釋成20 ng·mL－1的溶液，作為內標溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取肝爽顆粒樣品粉末約0.5 g，精密稱定，量于聚四氟乙烯消解罐中，加入濃HNO3溶液8 mL，混勻，于100℃下預消解30 min，待溫度降至60℃以下，輕輕振蕩后混勻置微波消解儀中，按照表1 設定的消解程序消解，消解完成后，待消解液冷卻至55℃取出，于通風櫥中80℃將硝酸揮發(fā)至約1 mL，轉入50 mL 量瓶中，用少量的水洗滌消解罐，洗滌3 次，洗液同時合并于量瓶中，加水定容至50 mL，搖勻，即得。同法制得空白樣品溶液。

表1 微波消解程序Tab 1 Program of microwave digestion

2.4 ICP-MS 工作條件

采用氦氣碰撞-動能歧視模式進行樣品分析，RF 功率1550 W；霧化室溫度2.7 ℃；輔助氣體積流量0.8 L·min－1；冷卻氣體積流量14 L·min－1；霧化氣體積流量1.031 L·min－1；蠕動泵泵速40.0 r·min－1；駐留時間0.05 ms；掃描次數(shù)25 次；反應池氣（He）體積流量5.4 mL·min－1；取樣錐為Ni 錐；采樣深度為10 mm。

2.5 測定方法

測定Na、B、Mg、Al、Ti、K、Cr、Ca、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Sr、Sn、Cd、Sb、Ba、Tl、Pb、Hg 共26 種元素，其中相對分子質量小于100 的元素采用Ge 作為內標、相對分子質量大于100 的元素采用In 作為內標。樣品按質量濃度由低到高依次進行測定。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關系考察 取“2.1”項下配制的各混合標準品溶液及Hg 單元素標準品溶液，進行測定，以標準品的質量濃度為橫坐標（X），強度結果為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得到各元素的線性方程及相關系數(shù)，結果見表2。

2.6.2 檢測限和定量限 連續(xù)測定空白樣品溶液11 次，測定元素信號響應值，以其信號響應值的標準偏差的3 倍所對應的質量濃度為檢測限（LOD），10 倍所對應的質量濃度為定量限（LOQ），結果見表2，各元素的檢測限和定量限均能滿足分析要求。

表2 26 種元素的線性關系、檢測限及定量限考察結果Tab 2 Linearity，LOD，and LOQ of 26 elements

2.6.3 精密度試驗 取“2.1”項下混合標準品溶液及Hg 單元素標準品溶液，連續(xù)進樣6 次，結果各元素精密度RSD在0.19%～4.2%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復性試驗 取肝爽顆粒（批號：200815）約0.5 g，精密稱定，按“2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，測定，計算各元素含量，結果Se、Mo、Sb、Tl、Hg 未檢出，其余各元素重復性RSD在0.82%～3.5%。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗 取肝爽顆粒（批號：200815）約0.5 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 測定，計算各元素RSD值，結果Se、Mo、Sb、Tl、Hg 未檢出，其余各元素的含量RSD在0.65%～4.7%。

2.6.6 加樣回收試驗 取肝爽顆粒（批號：200815）約0.25 g，精密稱定，加入濃HNO3溶液8 mL，加入與樣品中各元素質量相當?shù)幕旌蠘藴势啡芤杭?.5 μg·mL－1的Hg 標準品儲備液200 μL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行制備3 份，同法制備空白樣品溶液。測定各元素的含量，計算回收率。結果各元素的平均回收率在88.07%～106.82%，RSD在1.1%～4.9%。

2.7 樣品測定

取10 批肝爽顆粒，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”及“2.5”項下方法測定樣品中26 種無機元素的含量，結果見表3。

2.8 數(shù)據處理及分析

將ICP-MS 采集的數(shù)據導入Excel 表格中保存為CSV 格式，通過Metaboanalyst 5.0（https：//www.metaboanalyst.ca）網站生成Heatmaps 圖，使用軟件SPSS 25.0 對10 批肝爽顆粒的無機元素質量分數(shù)進行Pearson 相關性分析；將各元素的質量分數(shù)擴大或縮小到同一數(shù)量級，之后使用GraphPad Prism 6 軟件繪制肝爽顆粒的無機元素指紋圖譜及對照圖譜；采用軟件SPSS 25.0 對10 批肝爽顆粒的無機元素質量分數(shù)進行聚類分析，并使用軟件Simca 14.1 繪制PCA 散點圖，對肝爽顆粒進行均一性分析。采用軟件SPSS 25.0 對數(shù)據標準化后進行PCA，據初始特征值和累計貢獻率提取主成分因子，對提取的主成分因子進行載荷矩陣，由負荷量的大小來尋找肝爽顆粒的特征元素。

2.9 樣品中無機元素的測定結果及分析

10 批肝爽顆粒中26 種無機元素的測定結果見表3?？梢钥闯?，肝爽顆粒中26 種無機元素的含量差異很大，K 元素的含量最高，其平均質量分數(shù)為24 439.205 μg·g－1，其次含量較高的元素為Mg（2367.733 μg·g－1）、Na（956.278 μg·g－1）、Ca（532.418 μg·g－1）、Al（51.712 μg·g－1）、Fe（47.354 μg·g－1）、Mn（21.296 μg·g－1）。這些元素含量占26 種元素含量的99.38%，如圖1 所示，K、Mg、Na、Ca 大 于100 mg·kg－1，Al、Fe、Mn、Sr、B、Zn 在10 ～100 mg·kg－1內，Ba、Ti、Cu、Ni 在1 ～10 mg·kg－1內，As、Co、Cr、V、Pb、Sn、Cd 小于1 mg·kg－1。此外，Se、Mo、Sb、Tl、Hg 元素在部分肝爽顆粒批次中的含量低于檢測限?！吨袊幍洹?020年版中對中藥材的重金屬及有害元素的限度規(guī)定，Cu 不得過20 mg·kg－1、As 不得過2 mg·kg－1、Cd 不得過1 mg·kg－1、Hg 不得過0.2 mg·kg－1、Pb 不得過5 mg·kg－1。本試驗測定的10 批肝爽顆粒樣品中5 種重金屬元素Cu、As、Cd、Hg、Pb 均未超標，說明肝爽顆粒的重金屬含量在安全限度范圍之內。

圖1 肝爽顆粒各元素含量分析Fig 1 Content of each element in GSG

為了更直觀地表示不同批次肝爽顆粒中各無機元素的含量的高低，繪制Heatmaps 圖時，由于元素Se、Mo、Sb、Tl、Hg 在多批肝爽顆粒中含量低于檢測限，將這些數(shù)據剔除，結果見圖2。批號201217 樣品中Zn、Cr、Cu、Al 含量高外，其余各元素整體含量均較低。批號200814 和批號201216 樣品中V、Fe、Sn、As、B、Sr 含量均較高，其余各元素含量較低。由表3 和圖2 可見，同一元素在不同批次之間的含量存在一定差異，如Na 元素含量最低值為914.831 μg·g－1，最高可達1008.559 μg·g－1。由表3 可見，Cr 元素及Pb 元素的變異系數(shù)較大，其次是Zn 元素，說明在不同批次的樣品之間，Cr、Pb 和Zn 元素含量波動較大。而Ni 元素的變異系數(shù)較小，說明其含量在不同批間樣品之間較穩(wěn)定。

圖2 肝爽顆粒中無機元素含量的熱圖分析Fig 2 Heatmaps of inorganic elemental contents in GSG

表3 肝爽顆粒中無機元素的質量分數(shù)(n ＝3)Tab 3 Inorganic elemental content of GSG (n ＝3)

進一步分析各元素的Pearson 相關性，同樣剔除Se、Mo、Sb、Tl、Hg 元素數(shù)據。在圖3 中各元素的相關矩陣分列顯示，有11 對元素極顯著相關（P＜0.01），其中K 與Mg、Ca 與Mg、Ca 與K、Mn 與K、Cd 與Co 為正相關；Cu 與B、V 與Mg、Ca 與V、Fe 與V、Sr 與Cu、Pb 與Sn為負相關；有21 對元素顯著相關（P＜0.05），其中Mg 與Na，K 與Na、Ca 與Na、As 與B、Sr與B、Mn 與Mg、Ca 與Ti、Mn 與Ca、As 與V、Zn 與Cu、Cd 與Cu、Sr 與As、Sn 與As 為正相關。Zn 與B、Pb 與Al、V 與K、Sn 與K、As 與Ca、Pb 與Mn、As 與Cu、Cd 與Sr 為負相關。成正相關的18 對元素在被吸收積累過程中具有很好的協(xié)調作用，而成負相關的14 對元素在被吸收積累過程中具有拮抗作用。

圖3 肝爽顆粒中無機元素之間的Pearson 相關性分析Fig 3 Pearson correlation between inorganic elemental in GSG

2.10 無機元素量分布曲線及相似度分析

由于肝爽顆粒中26 種無機元素含量數(shù)量集差別較大，為了更直觀準確地繪制質量分數(shù)分布曲線，將不同元素的含量擴大或縮小至同一數(shù)量級（K 縮小1000 倍，Mg 縮小100 倍，Na、Ca 縮小10 倍，Ti、Ni、Cu、Ba 擴 大10 倍，Cr、V、Co、As、Pb 擴大100 倍，Sn、Cd 擴大1000 倍），以元素種類為橫坐標（相對含量為縱坐標），得到26 種元素質量分數(shù)分布曲線圖見圖4，10 批肝爽顆粒峰形相似，因批次不同，相對含量略有差異，但其譜線的形狀及走勢基本一致，故質量分數(shù)分布圖可作為肝爽顆粒的無機元素特征指紋圖譜，從整體上直觀顯示不同批次肝爽顆粒的差異，反映原料藥材來源、等級、制備工藝的穩(wěn)定性，有利于肝爽顆粒質量標準的完善。將10 批樣品以平均數(shù)和中位數(shù)分別生成肝爽顆粒的無機元素對照指紋圖譜，通過夾角余弦法計算10 批樣品與生成的對照圖譜的相似度，夾角余弦值接近1，說明相似程度高（見表4）。由表4 可見，10 批肝爽顆粒的指紋圖譜與平均數(shù)、中位數(shù)對照圖譜的夾角余弦值均大于0.976，說明各批次間無機元素指紋圖譜的相似度高，即不同批次的肝爽顆粒無機元素的質量均一性較好。

圖4 肝爽顆粒中無機元素質量分數(shù)Fig 4 Content distribution of inorganic elements in GSG

表4 肝爽顆粒無機元素指紋圖譜相似度分析Tab 4 Similarity evaluation on inorganic elemental fingerprint of GSG

2.11 基于多元統(tǒng)計分析的肝爽顆粒質量均一性評價

進一步采用多元統(tǒng)計分析對10 批肝爽顆粒的質量均一性進行分析。從聚類分析可以看出，10批樣本可分為3 組，201217 單獨為一組、200814和201216 為一組，其他樣本為一組（見圖5）。從PCA 散點圖可以看出200814 和201216 聚集在一起，201217 單獨為一組，其他樣本為一組（見圖6）。即PCA 和聚類分析結果基本一致。說明肝爽顆粒質量均一性較好。這3 批樣品與其他樣品存在差異的原因在于201217 樣品中Zn、Cr、Cu、Al 含量高外，其余各元素整體含量均較低。批號200814 和批號201216 中V、Fe、Sn、As、B、Sr含量均較高，其余各元素含量較低。

圖5 10 批肝爽顆粒無機元素的聚類分析Fig 5 Cluster analysis of inorganic elemental in 10 batches of GSG

圖6 10 批肝爽顆粒無機元素的PCA 散點圖Fig 6 PCA scatter plot of inorganic elemental in 10 batches of GSG

2.12 無機元素主成分分析

采用SPSS 25.0 軟件對上述10 批肝爽顆粒樣品的25 種無機元素（Hg 除外）數(shù)據進行PCA。PCA 可將原來的變量重新組合成一組新的綜合變量，并從中取出幾個較少的綜合變量盡可能多地反映原來的變量信息。根據Kaiser 準則（特征值大于1）及累計貢獻率準則（累計貢獻率達80%或85%以上），前5 個成分的特征值均大于1，累計貢獻率達92.369%，說明這5 個成分可以解釋92.369%的原始數(shù)據變量信息（見表5）。因此提取這5 個主成分的因子進行分析。由因子載荷矩陣（見表6，按負荷量的大小進行排序）可知，第一個主成分因子中Mg、K、Ca、Mo、Tl 的負荷量較大，第二個主成分因子中Cd、Se 的負荷量較大，第三個主成分因子中Zn 的負荷量較大，均在0.85 以上。所以確定Mg、K、Ca、Mo、Tl、Cd、Se、Zn 是肝爽顆粒的特征無機元素。正或負相關性元素對表明這些無機元素在治療過程（或吸收累積過程）中可能具有一定的協(xié)同或拮抗作用[16]。

表5 主成分的初始特征值和貢獻率Tab 5 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components

表6 前5 個主成分的因子載荷矩陣Tab 6 Factor loadings matrix of first five principal components

3 討論

本研究采用ICP-MS 對肝爽顆粒中26 種無機元素的含量進行了指紋圖譜分析，初步明確了其無機元素的組成。結果顯示肝爽顆粒中的無機元素以K、Mg、Na、Ca、Al、Fe、Mn 為主，含量最高的是K，其次是Mg、Na、Ca、Al、Fe、Mn，這7 種元素占測定元素總量的99.38%。通過計算不同元素的變異系數(shù)，發(fā)現(xiàn)Cr 及Pb 的波動較大，其次是Zn 元素。分析可能是同一產地不同批次或不同生長年份導致的差異。Pearson 分析顯示，這些不同元素含量之間存在一定相關性。此外，Cu、As、Cd、Hg、Pb 是對人體有害的微量元素，肝爽顆粒中Cu、As、Cd、Hg、Pb 的限量符合《中國藥典》2020年版以及《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》中對中藥材重金屬及有害元素的限度規(guī)定[17-18]。即從重金屬的角度來看，肝爽顆粒是安全的。進一步采用平均數(shù)和中位數(shù)法分別建立無機元素對照指紋圖譜，不同批次的樣品均有相似的峰形，且不同無機元素的多寡順序趨于一致。由于中藥元素譜分析數(shù)據量大，運用可以將抽象數(shù)據基于一定算法分成相似組的簡化數(shù)據方法，以及降維思想的PCA，在減少分析指標的同時，盡可能多地保留原指標包含的信息，也能較好地挖掘肝爽顆粒多批次間的共同特征[19]。從聚類分析、PCA 結果來看，肝爽顆粒無機元素的質量均一性較好。PCA 結果顯示，Mg、K、Ca、Mo、Tl、Cd、Se、Zn 是肝爽顆粒的特征無機元素，其中，Mg 存在于線粒體中，是參與代謝功能的重要輔助因子，有研究表明Mg 的缺乏會導致肝硬化加重，而服用Mg 則可以緩解肝硬化[20]；K元素可以改善細胞膜纖維化，增強細胞膜的通透性，有助于損傷組織細胞的再生修復[21]。Se 元素在人體的多種調節(jié)和代謝中起著重要的作用，對于肝硬化患者體內元素的平衡是有益的[22]；Zn 元素在各種Zn 酶中起著至關重要的作用，而Zn 酶可維持肝功能，患有慢性肝病的患者通常Zn 含量較低，隨著肝纖維化的進展，Zn 濃度會進一步降低，補充Zn 對于維持肝功能、抑制肝癌的發(fā)展有一定的作用[23]。本研究結果顯示肝爽顆粒含有治療肝臟類疾病的必需元素，這也為后續(xù)研究藥效發(fā)揮及之間的協(xié)同作用提供了參考。