黃晶，李爽，樊慧敏，吳春芝，谷福根（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特 010050）

阿爾茨海默?。ˋD）是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變及語(yǔ)言障礙等癥狀，嚴(yán)重影響社交、職業(yè)與生活功能。皮質(zhì)膽堿能神經(jīng)元遞質(zhì)功能紊亂被認(rèn)為是記憶障礙及其他認(rèn)知功能障礙的原因之一[1]。鹽酸多奈哌齊（donepezil hydrochloride，DPZ）是第二代中樞乙酰膽堿酯酶（AchE）抑制劑，具有藥理活性高、選擇性強(qiáng)、安全性好等特點(diǎn)，是目前臨床治療輕中度AD 的一線藥物[2-3]。鹽酸多奈哌齊上市劑型有片劑、膠囊劑等，但口服給藥吸收慢，生物利用度低，外周不良反應(yīng)多，進(jìn)入腦內(nèi)藥量少，其臨床療效受到限制[4]。鼻腔給藥具有吸收快、生物利用度高、腦靶向給藥等特點(diǎn)。因此，近年來(lái)，國(guó)外研究報(bào)道，將鹽酸多奈哌齊制成納米混懸液、脂質(zhì)納米粒、微乳、脂質(zhì)體等鼻腔給藥新劑型，并初步評(píng)價(jià)其腦靶向性[5-8]。本文在前期制備鹽酸多奈哌齊鼻用溫敏凝膠并評(píng)價(jià)其在動(dòng)物體內(nèi)腦靶向性的基礎(chǔ)上[9-10]，進(jìn)一步研究其在大鼠腦組織內(nèi)藥動(dòng)學(xué)與抑制腦組織AchE 活性的藥效學(xué)之間的相關(guān)性。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀（配備SPD-20A 熒光檢測(cè)器，日本島津公司）；AB265-S 型電子分析天平（瑞士梅特勒·托利多公司）；LN 9527-25型高速離心機(jī)（德國(guó)雅培公司）；TD4C 臺(tái)式低速離心機(jī)（江蘇大唐醫(yī)療器械有限公司）；721G 可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸多奈哌齊對(duì)照品（湖北鴻鑫瑞宇精細(xì)化工有限公司，純度為99.79%，批號(hào)：160401）；鹽酸多奈哌齊鼻用溫敏凝膠劑（自制，批號(hào)：20200910，含量：5%）；碘化乙酰硫代膽堿（AThCh，純度為98%，批號(hào)：H21M9F61841）、二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB，純度為98%，批號(hào)：Y21D9K78215）、谷胱甘肽（純度為99%，批號(hào)：Z17S10C97807）（上海源葉生物科技有限公司）；水楊酸毒扁豆堿（上海摩楷生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，邁瑞達(dá)科技有限公司）；甲醇（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；水為超純水，甲基叔丁醚、鹽酸、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SD 大鼠132 只，SPF 級(jí)， 雄性， 體質(zhì)量250 ～350 g [內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（蒙）2016-0001]。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥動(dòng)學(xué)研究

2.1.1 色譜條件[11]色譜柱：Inert Sustain C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；保護(hù)柱：WondaSil C18（10 mm×4 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.01 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液（30∶70）；流速：1.2 mL·min－1；激發(fā)波長(zhǎng)：325 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：390 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 腦組織樣品的處理[12]將全腦組織用生理鹽水清洗干凈，用濾紙吸干水分，稱定質(zhì)量，按1∶3 的比例加入生理鹽水，在冰水混合浴中采用玻璃勻漿器勻漿，將勻漿液以13 000 r·min－1離心10 min，取上清液100 μL 置于另一EP 管中，加入20 μL 0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液，旋渦混勻，加入300 μL 甲基叔丁醚，旋渦振蕩3 min，13 000 r·min－1離心5 min，取上清液200 μL 置于另一EP 管中，40℃水浴中氮?dú)饬鞔蹈?。殘?jiān)?00 μL 甲醇溶解，進(jìn)樣。

2.1.3 專屬性考察 分別取大鼠空白腦勻漿、空白腦勻漿加鹽酸多奈哌齊對(duì)照品、鹽酸多奈哌齊鼻用凝膠給藥10 min 后的腦勻漿樣品各100 μL。按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，記錄色譜圖[12]。結(jié)果在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下，鹽酸多奈哌齊保留時(shí)間為5.3 min，峰形良好，且無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取鹽酸多奈哌齊對(duì)照品適量，以水為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為60.0、300.0、600.0、1200.0、2400.0、3600.0、4800.0 ng·mL－1的系列對(duì)照品溶液。取空白腦勻漿100 μL，分別加入系列對(duì)照品溶液適量，制備質(zhì)量濃度分別為10.0、50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0 ng·mL－1的鹽酸多奈哌齊標(biāo)準(zhǔn)腦勻漿樣品，依照“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定。以腦勻漿中鹽酸多奈哌齊的質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，其色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)，作線性回歸，得回歸方程為：A＝105C＋4888.2（r＝0.9994），表明腦勻漿中鹽酸多奈哌齊質(zhì)量濃度在10.0 ～800.0 ng·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度與回收率考察 配制質(zhì)量濃度分別為50.0、200.0、600.0 ng·mL－1的鹽酸多奈哌齊腦勻漿質(zhì)控樣品，各平行5 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)定5 次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果日內(nèi)與日間精密度RSD均小于5%，表明該方法的精密度良好。同時(shí)，將每個(gè)質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品測(cè)得的藥物峰面積（A），代入當(dāng)日測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算方法的相對(duì)回收率。將上述質(zhì)控樣品對(duì)應(yīng)相同濃度鹽酸多奈哌齊水溶液直接進(jìn)樣，測(cè)得峰面積（B），以A/B計(jì)算方法的提取回收率。結(jié)果方法的相對(duì)回收率在96.29%～104.28%，提取回收率在97.12%～104.43%，均符合生物樣品測(cè)定要求。

2.1.6 檢測(cè)限與定量限的考察 分別配制系列低濃度鹽酸多奈哌齊腦勻漿樣品，處理后進(jìn)樣，記錄色譜圖，以信噪比（S/N＝3）作為檢測(cè)限，S/N＝10 為定量限。測(cè)得該方法的檢測(cè)限為3.3 ng·mL－1，定量限為10 ng·mL－1。

2.1.7 穩(wěn)定性考察 配制質(zhì)量濃度分別為50.0、200.0、600.0 ng·mL－1的腦勻漿樣品，考察在室溫下放置24 h，處理后在進(jìn)樣室放置24 h，凍-融循環(huán)3 次，－20 ℃冷凍放置5 d 的穩(wěn)定性，結(jié)果不同質(zhì)量濃度鹽酸多奈哌齊腦勻漿樣品的RSD均＜13%，均具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.8 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn) 用乙醚麻醉大鼠，切開頸部皮膚，分離食管、氣管，行氣管插管，并在食管上作一切口，插入一段聚乙烯管至鼻腔后部，手術(shù)線固定，用微量注射器吸取鹽酸多奈哌齊鼻用溫敏凝膠劑，給藥劑量為10 mg·kg－1，沿聚乙烯管伸入大鼠鼻腔后部緩慢推入，給藥完畢后立即拔出聚乙烯管，將食管結(jié)扎。分別于給藥3、5、10、20、30、45 min，1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h各處死6 只大鼠。迅速分離全腦組織，于－20 ℃條件下保存，備用。

腦勻漿中鹽酸多奈哌齊的濃度見表1。將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物腦組織中的藥物濃度取均值，繪制腦組織鹽酸多奈哌齊濃度均值-時(shí)間曲線圖，結(jié)果見圖1?？梢?，鹽酸多奈哌齊鼻用溫敏凝膠經(jīng)鼻給藥后，由鼻黏膜吸收進(jìn)入腦組織的速度很快，tmax約為10 min，Cmax高達(dá)10 758.94 ng·g－1，腦藥濃度達(dá)峰值后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)快速下降。

2.2 藥效學(xué)研究[13]

2.2.1 腦勻漿樣品的制備 取大鼠全腦組織，生理鹽水洗凈后，用濾紙吸干水分，稱定質(zhì)量，再加3 倍體積0.1 mol·L－1pH 7.4 的PBS 采用玻璃勻漿器在冰水浴條件下勻漿。然后，將腦勻漿液以10 000 r·min－1離心5 min，取上清液置于EP管中，備用。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取1.0 mmol·L－1谷胱甘肽液（雙蒸餾水配制）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 置于6 支試管中，均加入0.1 mol·L－1pH 7.4 的PBS 1.0 mL，加蒸餾水至1.5 mL，再加2 mmol·L－1的DTNB 1.0 mL（pH 7.0 的PBS 配制）制成相當(dāng)于腦組織含0、50、100、150、200、250 U·g－1AchE活性的溶液。以不含谷胱甘肽的樣品為空白，用分光光度計(jì)于412 nm 處測(cè)定樣品的吸光度。以樣品液的酶活性（E，U·g－1）為橫坐標(biāo)，其吸光度（A）為縱坐標(biāo)，作線性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A＝0.0097E＋0.011，r＝0.9984，表明在0 ～250 U·g－1酶活性范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2.3 腦組織AchE 的測(cè)定 取大鼠，給藥方法和給藥劑量同“2.1.8”項(xiàng)下。分別于給藥3、5、10、20、30、45 min 及1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h斷頭處死，立即分離全腦組織，并制備腦勻漿樣品。將每份腦勻漿上清液分為供試管和對(duì)照管，兩管內(nèi)各加入上清液100 μL，再在對(duì)照管中加入0.1% 水楊酸毒扁豆堿（蒸餾水配制）1 滴，兩管各加入pH 7.4 的PBS 1.9 mL，混勻，置37℃水浴中預(yù)熱5 min，各管加入2.5 mmol·L－1AThCh 底物液（雙蒸餾水配制）0.5 mL，混勻，37℃水浴15 min，測(cè)定管中加入0.1% 水楊酸毒扁豆堿l 滴以終止反應(yīng)，最后在兩管中各加入 2.0 mmol·L－1的DTNB 溶液0.5 mL，混勻，4000 r·min－1離心15 min 后，分取上清液，以對(duì)照管溶液為空白，用可見分光光度計(jì)于412 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算腦組織的AchE 活性，結(jié)果見表1。將測(cè)得的腦組織AchE 活性取均值對(duì)時(shí)間作曲線圖，結(jié)果見圖1?？梢?，鹽酸多奈哌齊鼻用溫敏凝膠經(jīng)鼻腔給藥后，腦組織中AchE 的活性很快下降，酶活性最低值（Emin）出現(xiàn)在給藥后10 min，與腦組織中藥物峰濃度的tmax一致。隨后，AchE 活性隨著腦組織中鹽酸多奈哌齊濃度的下降逐漸回升并最終達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)。將大鼠腦組織中鹽酸多奈哌齊濃度（Y）與對(duì)應(yīng)相同時(shí)間點(diǎn)腦組織中AchE 活性（X）進(jìn)行回歸分析[14-15]，求得回歸方程為：Y＝－449.15X＋22 315，r＝0.9652（P＜0.001），表明兩者之間成負(fù)相關(guān)。

圖1 鹽酸多奈哌齊鼻用溫敏凝膠在大鼠腦組織中藥物濃度與AchE活性-時(shí)間曲線Fig 1 Drug concentration and AchE activity-time curves after the administration of donepezil hydrochloride thermosensitive nasal gel in rats

表1 鹽酸多奈哌齊鼻用溫敏凝膠劑在大鼠腦組織中藥物濃度與AchE 活性(x±s，n ＝4 ～6)Tab 1 Drug concentration and AchE activity in the brain tissues after the administration of donepezil hydrochloride thermosensitive nasal gel in rats (x±s，n ＝4 ～6)

3 討論

鹽酸多奈哌齊治療AD 主要是通過(guò)抑制腦組織內(nèi)AchE 活性來(lái)發(fā)揮作用。本文大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示，鹽酸多奈哌齊鼻用溫敏凝膠經(jīng)鼻腔給藥后，藥物進(jìn)入腦組織的速度很快，tmax僅為10 min，此后腦藥濃度快速下降，提示該鼻用凝膠劑中藥物釋放較快且完全，無(wú)緩釋長(zhǎng)效作用。另外，課題組前期研究已證實(shí)，該鼻用凝膠劑亦具有明顯腦靶向性[10]。

大鼠體內(nèi)藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸多奈哌齊鼻用凝膠給藥后，在實(shí)驗(yàn)的鹽酸多奈哌齊濃度范圍內(nèi)，腦組織內(nèi)AchE 的活性隨著藥物濃度快速升高而下降，其活性最低值出現(xiàn)時(shí)間與腦組織內(nèi)藥物的tmax完全相同，即腦組織鹽酸多奈哌齊濃度達(dá)峰值時(shí)，AchE 的活性最?。辉趖max之后，隨著腦組織內(nèi)鹽酸多奈哌齊濃度的下降，AchE 的活性逐漸回升并趨于穩(wěn)定。腦中AchE 活性的變化與腦內(nèi)鹽酸多奈哌齊濃度的變化趨勢(shì)相反，即藥物對(duì)腦中AchE 活性抑制效應(yīng)的大小與腦藥濃度變化完全同步，提示無(wú)藥物滯后效應(yīng)存在。腦組織AchE 活性與腦藥濃度相關(guān)性擬合結(jié)果顯示，相關(guān)系數(shù)r值大于0.9，斜率為負(fù)值，表明鹽酸多奈哌齊在腦組織內(nèi)對(duì)AchE 活性抑制作用強(qiáng)弱與其濃度成明顯正相關(guān)。這一現(xiàn)象，再次證實(shí)了鹽酸多奈哌齊用于治療AD 的主要藥理機(jī)制，對(duì)于今后研究開發(fā)鹽酸多奈哌齊鼻腔途徑給藥新制劑和預(yù)測(cè)現(xiàn)上市制劑的臨床療效具有指導(dǎo)作用。另外，作者曾采用DAS3.3.0 藥動(dòng)學(xué)軟件，嘗試對(duì)腦組織鹽酸多奈哌齊濃度與藥效學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行PK-PD 結(jié)合模型擬合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者之間并不符合經(jīng)典的Sigmoid Emax 模型（Hill 模型）機(jī)制[16]。至于采用何種PK-PD 結(jié)合模型進(jìn)行分析比較合適，有待進(jìn)一步探討。