翟文姣，張德斌，李紅，郭紹芬*，于秀玲，徐勤（1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541000；.臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東 臨沂 76005）

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19，簡稱新冠肺炎）疫情爆發(fā)后，國家衛(wèi)健委與國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥推薦使用“清肺排毒湯”來治療新冠肺炎[1]。臨床數(shù)據(jù)表明，其能降低患者病死率和改善呼吸癥狀，對(duì)新冠肺炎有很好的治療效果[2-3]。清肺排毒湯包含麻黃、炙甘草、杏仁、生石膏、桂枝、澤瀉、豬苓、白術(shù)、茯苓、柴胡、黃芩、姜半夏、姜、枳實(shí)、陳皮、藿香、射干、細(xì)辛、山藥、紫菀、冬花等21 味中藥材[4-5]，主要由射干麻黃湯、麻杏石甘湯、小柴胡湯以及五苓散等經(jīng)典名方組成，具有清熱解毒、健脾利濕、宣肺平喘的功效[6]。清肺排毒湯的化學(xué)成分主要有黃酮類、皂苷類、生物堿類等[1]，該方具有抗病毒、抗炎、解熱等多種功能，并且可以通過多成分、多靶點(diǎn)作用于新冠肺炎[3，7]。麻黃具有抗炎、平喘、利尿、興奮中樞神經(jīng)等藥理作用[8-9]，其主要有效成分為生物堿類[10]。甘草具有抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤等藥理作用[11-12]。黃芩具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化等藥理作用[13]。

中藥包含多種復(fù)雜的化學(xué)成分，其治療效果歸因于多種成分的協(xié)同作用，因此建立合適的多成分含量測定方法是非常有必要的。

目前關(guān)于清肺排毒湯煎煮工藝的研究鮮有報(bào)道，合理的煎煮方法不僅有助于提高湯劑的質(zhì)量，更是有利于其發(fā)揮臨床藥效[14]。本試驗(yàn)選擇響應(yīng)面法來考察煎煮工藝[15-16]。同時(shí)出膏率也可以作為指示中藥活性成分的標(biāo)志[17]。

因此本試驗(yàn)建立同時(shí)測定清肺排毒湯中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、甘草苷、黃芩苷、黃芩素含量的高效液相色譜法，并且通過單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)從浸泡時(shí)長、液料比、煎煮時(shí)長等因素優(yōu)選清肺排毒湯的煎煮工藝。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260HPLC 色譜儀（安捷倫科技有限公司）；KDM 型電熱套（山東鄄城魯華電熱儀器有限公司）；飛鴿牌TDL-80-2B 臺(tái)式低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；科興HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市金壇科興儀器廠）；FA1204 電子分析天平（上海菁海儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品鹽酸麻黃堿（批號(hào)：171241-201809）、鹽酸偽麻黃堿（批號(hào)：171237-201510）（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用）；對(duì)照品甘草苷（批號(hào)：AF20071952）、黃芩素（批號(hào)：AF8030808）、黃芩苷（批號(hào)：AF20021201）（成都埃法生物科技有限公司，純度均≥98%）。甲醇、乙腈（色譜純，TEDIA）、磷酸（分析純，DAMAO）、超純水（自制）；生姜購于超市，麻黃、炙甘草、杏仁、生石膏、桂枝、澤瀉、豬苓、白術(shù)、茯苓、柴胡、黃芩、姜半夏、枳實(shí)、陳皮、藿香、射干、細(xì)辛、山藥、紫菀、冬花等20 味藥材，均購于臨沂市藥材市場，以上藥材經(jīng)臨沂大學(xué)藥學(xué)院辛杰副教授鑒定符合2020年版《中國藥典》一部項(xiàng)下規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 樣品溶液的制備 稱取處方量藥材加8 倍量水，浸泡40 min，煎煮兩次。第一次煎煮50 min（石膏先煎15 min），趁熱過100目篩（6號(hào)篩），藥渣加入6 倍量水，第二次煎煮40 min，趁熱過100 目篩，合并兩次濾液得清肺排毒湯水煎液。

精密量取上述水煎液5 mL 置于10 mL 量瓶中，加入甲醇4 mL，超聲（142 W，40 kHz）10 min，甲醇定容。2000 r·min－1離心10 min 后吸取上清液，過0.45 μm 濾膜，即得清肺排毒湯供試液。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、甘草苷、黃芩素對(duì)照品適量用甲醇溶解搖勻，即得母液。精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，用50%甲醇溶解定容得其母液。精密吸取上述對(duì)照品母液適量并用甲醇定容，混合搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾即得混合對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序見表1；檢測波長為210 nm；柱溫為25℃；流速為1 mL·min－1；進(jìn)樣量為10 μL。HPLC 色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

圖1 樣品（A）與混合對(duì)照品（B）的HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of sample（A）and mixed reference substance（B）

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系的考察 精密量取混合對(duì)照品溶液適量，用甲醇溶解，定容，稀釋得不同濃度的混合對(duì)照品溶液。過0.45 μm 濾膜，進(jìn)樣測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，各化合物在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，見表2。

表2 線性關(guān)系考察Tab 2 Linearity

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別記錄鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、甘草苷、黃芩苷、黃芩素的峰面積，計(jì)算其RSD均＜5%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于0、2、4、12、24 h 進(jìn)樣測定，分別記錄鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、甘草苷、黃芩苷、黃芩素的峰面積，計(jì)算其RSD均＜5%，表明該樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液6 份，進(jìn)樣測定，分別記錄鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、甘草苷、黃芩苷、黃芩素的峰面積，計(jì)算其RSD均＜5%，表明該檢測方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的水煎液6份，分別加入5 種對(duì)照品溶液適量，制備加樣供試品溶液，測定各成分的含量，計(jì)算回收率。鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、甘草苷、黃芩苷、黃芩素5 種成分的平均回收率分別為102.09%、103.60%、98.19%、98.76%、97.01%，其RSD值分別為2.8%、3.3%、4.2%、4.0%、3.9%。結(jié)果表明該方法回收率良好。

2.4 出膏率

精密量取藥液25 mL，放在恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃下干燥3 h，置干燥器中冷卻，迅速精密稱定，計(jì)算出膏率[18]。

2.5 單因素試驗(yàn)

以浸泡時(shí)長、液料比、一次煎煮時(shí)長、二次煎煮時(shí)長為影響煎煮工藝的因素，并對(duì)其進(jìn)行篩選。以綜合加權(quán)評(píng)分法研究各因素對(duì)清肺排毒湯煎煮工藝的影響，確定出膏率和指標(biāo)成分含量權(quán)重系數(shù)[19-21]，用以下公式進(jìn)行綜合評(píng)分計(jì)算，綜合評(píng)分＝100×XA/XAmax×0.1 ＋100×XB/XBmax×0.1 ＋100×XC/XCmax×0.1 ＋100×XD/XDmax×0.2 ＋100×XE/XEmax×0.1 ＋100×Y/Ymax×0.4（XA為鹽酸麻黃堿含量，XB為鹽酸偽麻黃堿含量，XC為甘草苷含量，XD為黃芩苷含量，XE為黃芩素含量，Y為出膏率）。

2.5.1 浸泡時(shí)長對(duì)煎煮結(jié)果的影響 稱取清肺排毒湯藥材，加8 倍量水分別浸泡0、15、30、40、50、60 min，煎煮50 min（石膏先煎15 min），再加入6 倍量水煎煮40 min，合并藥液，進(jìn)樣測定各指標(biāo)成分含量與出膏率。采用綜合評(píng)分法對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，其綜合評(píng)分分別為86.97、94.58、96.07、88.45、89.49、84.81。結(jié)果表明隨著浸泡時(shí)長的增加評(píng)分先增加后降低，當(dāng)浸泡時(shí)長為30 min 時(shí)評(píng)分達(dá)到最高，可能是隨著浸泡時(shí)長的增加，水分子進(jìn)入藥材細(xì)胞內(nèi)部的量增大，促進(jìn)了有效成分的溶出。故選取15、30、45 min 進(jìn)一步考察。

2.5.2 液料比對(duì)煎煮結(jié)果的影響 稱取清肺排毒湯藥材，分別加6、7、8、9、10 倍水浸泡40 min，一次煎煮時(shí)長50 min（石膏先煎15 min），二次煎煮加入6 倍量水煎煮40 min，合并藥液，進(jìn)樣測定其指標(biāo)成分含量與出膏率。采用綜合評(píng)分法對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，其綜合評(píng)分分別為72.99、84.84、81.81、93.32、96.48。結(jié)果表明隨著液料比的增加，評(píng)分逐步上升，液料比越大有效成分的溶出量越多，但是考慮實(shí)際操作與使用方便故選擇液料比8、9、10 進(jìn)一步考察。

2.5.3 一次煎煮時(shí)長對(duì)煎煮結(jié)果的影響 稱取清肺排毒湯藥材，加入8 倍量水浸泡40 min，分別一次煎煮時(shí)長30、40、50、60、70 min（石膏先煎15 min），再二次煎煮加入6 倍量水煎煮40 min，合并藥液，進(jìn)樣測定其指標(biāo)成分含量與出膏率。采用綜合評(píng)分法對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，其綜合評(píng)分分別為82.30、93.95、97.23、87.43、82.80。結(jié)果表明隨著一次煎煮時(shí)長的增加綜合評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在50 min 時(shí)達(dá)到最大值?？赡苡捎陔S著煎煮時(shí)長的增加，有效成分結(jié)構(gòu)被破壞并且雜質(zhì)的溶出也增加。故選擇40、50、60 min 進(jìn)一步考察。

2.5.4 二次煎煮時(shí)長對(duì)煎煮結(jié)果的影響 稱取清肺排毒湯藥材，加入8 倍量水浸泡40 min，一次煎煮40 min（石膏先煎15 min），二次煎煮加入6倍量水分別煎煮20、30、40、50、60 min，合并兩次藥液，進(jìn)樣測定指標(biāo)成分含量與出膏率。采用綜合評(píng)分法對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，其綜合評(píng)分分別為95.64、89.56、87.41、92.74、89.45。結(jié)果表明隨著二次煎煮時(shí)長的增加綜合評(píng)分呈現(xiàn)無規(guī)律變化。指標(biāo)成分含量整體趨勢(shì)為逐漸下降，而出膏率則是先升后降，因此，二次煎煮時(shí)長相對(duì)以上3 個(gè)因素對(duì)煎煮結(jié)果影響并不顯著。故響應(yīng)面試驗(yàn)選擇浸泡時(shí)長、液料比、一次煎煮時(shí)長為考察因素，二次煎煮時(shí)長為30 min 來進(jìn)行試驗(yàn)。

2.6 Box-Behnken 響應(yīng)面法試驗(yàn)

2.6.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取浸泡時(shí)長（A）、液料比（B）、煎煮時(shí)長（C）為考察因素，以出膏率和指標(biāo)成分含量綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，使用Design-Export.V8.0.6 軟件進(jìn)行Box-Behnken 中心點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平表Tab 3 Factor and level for response surface test

2.6.2 響應(yīng)面試驗(yàn)與結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表4，以出膏率和指標(biāo)成分含量綜合得分為指標(biāo)，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果對(duì)模型進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，其數(shù)學(xué)模型為：綜合評(píng)分＝84.920－0.61A＋0.11B＋4.47C＋0.44AB＋0.005484AC＋2.22BC＋1.98A2＋2.86B2－1.25C2。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 4 Response surface test

2.6.3 方差分析 由表5 可知，該模型的F值為5.59，P值為0.0362（＜0.05），說明模型顯著。該模型R2＝0.9097，失擬項(xiàng)P＝0.8034（不顯著）表明模型擬合良好，對(duì)結(jié)果有較好的預(yù)測。由表5 可知，A（浸泡時(shí)長）、B（液料比）、C（煎煮時(shí)長）三因素對(duì)結(jié)果的影響順序?yàn)镃＞A＞B，C對(duì)結(jié)果的影響顯著。各因素交互影響的順序?yàn)锽C＞AB＞AC，但其對(duì)結(jié)果影響均不顯著。根據(jù)回歸分析的結(jié)果，對(duì)其作出響應(yīng)曲面圖，如圖2。

表5 方差分析結(jié)果Tab 5 Analysis of variance

2.6.4 各因素的交互作用 由圖2 可知，煎煮時(shí)長較液料比與浸泡時(shí)長對(duì)綜合評(píng)分的影響更大，煎煮時(shí)長與液料比有較明顯的交互作用，隨著煎煮時(shí)長的增大，綜合評(píng)分的變化趨勢(shì)較明顯。隨著浸泡時(shí)長的增加，綜合評(píng)分趨勢(shì)變化并不明顯，與單因素考察結(jié)果一致。隨著液料比的增大，綜合得分整體趨勢(shì)呈上升狀，但變化不明顯。

圖2 浸泡時(shí)長、液料比、煎煮時(shí)長對(duì)綜合評(píng)分的交互影響Fig 2 Interactive influence of soaking time，liquid solid ratio，and decoction time on the comprehensive score

2.6.5 工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證 根據(jù)Design-Export.V8.0.6 對(duì)其煎煮工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定了清肺排毒湯最佳煎煮工藝為浸泡時(shí)長15 min，液料比10∶1，一次煎煮60 min（石膏先煎15 min），二次煎煮8 倍水煎煮30 min，過濾，合并兩次藥液即得，在此條件下的綜合評(píng)分為95.75。按照此條件平行3 次試驗(yàn)驗(yàn)證，其平均綜合評(píng)分為93.80，RSD＝2.9%（n＝3），與預(yù)測值接近，說明該模型預(yù)測性良好。最終確定了清肺排毒湯的最佳煎煮工藝。

3 討論

中藥含量測定首選有效成分，且一般按照君臣佐使的順序來選定藥材進(jìn)行檢測[22]。麻黃為清肺排毒湯組成方麻杏石甘湯與射干麻黃湯的君藥，黃芩為組成方小柴胡湯中臣藥，甘草為佐使藥[23]。2020年版《中國藥典》一部[24]規(guī)定麻黃中指標(biāo)成分為鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿；黃芩中指標(biāo)成分為黃芩苷，小柴胡顆粒含量測定指標(biāo)為黃芩中的有效成分，故將黃芩苷和黃芩素作為含量測定指標(biāo)之一，甘草苷為甘草的指標(biāo)成分之一，綜上，本次試驗(yàn)選取了鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、黃芩苷、黃芩素與甘草苷為指標(biāo)成分進(jìn)行研究。

在建立高效液相色譜法中分別考察了以甲酸水-乙腈，磷酸水-乙腈為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)磷酸水-乙腈條件下峰形與基線效果均優(yōu)于甲酸水-乙腈，故最后選取0.1%磷酸水-乙腈為流動(dòng)相。在檢測波長的選取中發(fā)現(xiàn)在210 nm 下目標(biāo)峰有較好的吸收，故最終選取了210 nm 為檢測波長。

目前關(guān)于清肺排毒湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究較少，本試驗(yàn)建立了HPLC 法同時(shí)測定清肺排毒湯中5種成分的含量，并且通過單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)選出了清肺排毒湯的最佳煎煮工藝，有助于清肺排毒湯進(jìn)一步的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。