董琳琳，豐晨然，趙一穎，石璐，吳師月，靖衛(wèi)霞，賈占紅，孫文燕*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 0488；.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 0009）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種漸進(jìn)性自身免疫性疾病，其特征在于關(guān)節(jié)滑膜慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞增殖與凋亡異常及關(guān)節(jié)軟骨與骨損害。RA 致殘率較高，還易導(dǎo)致其他并發(fā)癥，使得臨床患者的治療愈加困難[1]。RA 屬中醫(yī)“痹證”范疇，中醫(yī)藥在治療“痹證”方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。芍甘附子湯源于《傷寒論》，由芍藥、炙甘草、附子組成，臨床上運(yùn)用該方或以該方為基礎(chǔ)進(jìn)行加減治療RA 療效確切，但尚缺乏系統(tǒng)的藥效學(xué)及作用機(jī)制研究[2]。

NF-κB 信號(hào)通路是經(jīng)典的炎癥通路，該通路激活后可促進(jìn)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶（COX-2）等炎性因子的轉(zhuǎn)錄，還可調(diào)節(jié)T、B 細(xì)胞的分化，促進(jìn)RA 的發(fā)生發(fā)展[3]。PPAR-γ是一種重要的抗炎轉(zhuǎn)錄因子，其抗炎作用可能與抑制核因子κB（NF-κB）的活化有關(guān)[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明芍甘附子湯對(duì)RA 的干預(yù)作用可能與PPAR-γ/NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)[5]。本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，觀(guān)察芍甘附子湯對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠的干預(yù)作用并基于PPAR-γ/NF-κB 信號(hào)通路探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)Wistar 大鼠102 只， 體質(zhì)量180 ～190 g，雄性[北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0002]。

1.2 試藥

芍甘附子湯配方顆粒（黑順片3 g、白芍9 g、甘草9 g，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，由北京康仁堂藥業(yè)制備）。給藥時(shí)以生理鹽水充分溶解，按照人日用量換算大鼠的等效劑量為2.1 g 生藥·kg－1。雷公藤多苷片（得恩德制藥股份有限公司，批號(hào)為2004114B，給藥質(zhì)量濃度為0.9 mg·mL－1）。

牛Ⅱ型膠原（美國(guó)Chondrex 公司）；不完全弗氏佐劑（美國(guó)Sigma 公司）；前列腺素E2（PGE2）試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所）；一氧化氮（NO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒（北京瑞格博科技發(fā)展有限公司）；鼠單抗PPAR-γ抗體、兔多抗NF-KB p65 抗體、兔多抗COX-2 抗體、兔單抗iNOS 抗體（英國(guó)Abcam 公司）；兔單抗p-NF-κB p65 抗體（中國(guó)HUABIO 公司）。

1.3 儀器

YLS-7B 大鼠足跖容積測(cè)量?jī)x（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；TU-1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；華衛(wèi)德朗DR-200BS 酶標(biāo)分析儀（無(wú)錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司）；Thermo Multiskan MK3 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；DKZ-2B 恒溫振蕩水槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Tissue-TEK VIP6 生物組織脫水機(jī)、Tissue-TEK TEC 生物組織包埋機(jī)（日本櫻花公司）；Leica RM2235 組織切片機(jī)、Leica HI1210 撈片儀、Leica HI1220 烤片儀、Leica ST5020 自動(dòng)染色機(jī)、Leica CV5030 自動(dòng)封片儀、Olympus Bx53 顯微鏡、Path QC 病理質(zhì)控和資料管理系統(tǒng)（德國(guó)萊卡公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 模型復(fù)制[6]

102 只Wistar 大鼠于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。隨機(jī)選取12 只，并將其作為正常組，其余90 只用于CIA 大鼠模型制作。實(shí)驗(yàn)第1日將牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑充分等量混合，手持勻漿器充分乳化。準(zhǔn)確抽取0.2 mL 乳化劑在大鼠的尾根部進(jìn)行多點(diǎn)皮內(nèi)注射。實(shí)驗(yàn)第7日再次進(jìn)行免疫，乳化劑用量為0.1 mL。正常組采用等量的生理鹽水進(jìn)行皮內(nèi)注射。實(shí)驗(yàn)第14日對(duì)造模大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評(píng)分[6]，評(píng)分≥4 分為模型復(fù)制成功，造模成功率為83.33%（75 只）。

2.2 分組及給藥

按照AI 評(píng)分結(jié)果，依據(jù)分層分配法進(jìn)行分組：CIA 模型組，芍甘附子湯低劑量組（1.05 g·kg－1），芍甘附子湯中劑量組（2.1 g·kg－1），芍甘附子湯高劑量組（4.2 g·kg－1）以及雷公藤多苷片組（9 mg·kg－1），每組15 只。各組按照劑量灌胃，每日1 次，連續(xù)28 d。正常組及CIA模型組灌胃等量生理鹽水。

2.3 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分

于實(shí)驗(yàn)第14、21、28、35、42日對(duì)模型組、芍甘附子湯組及雷公藤多苷片組大鼠進(jìn)行AI 評(píng)分。

2.4 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集

于末次給藥24 h 后，用1.5%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，4℃，4000 r·min－1，離心10 min，收集血清。取大鼠雙側(cè)踝關(guān)節(jié)，以4%多聚甲醛溶液中固定。

2.5 踝關(guān)節(jié)病理學(xué)及影像學(xué)觀(guān)察

每組隨機(jī)選取6 只大鼠踝關(guān)節(jié)脫鈣，常規(guī)脫水處理并石蠟包埋，制片，常規(guī)HE 染色，于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察病理變化，并根據(jù)滑膜上皮細(xì)胞、滑膜間質(zhì)細(xì)胞及滑膜軟骨組織病變程度進(jìn)行踝關(guān)節(jié)病變?cè)u(píng)分。各組另取踝關(guān)節(jié)置于Inveon MM GANTRY 掃描儀上進(jìn)行掃描。掃描儀設(shè)置參數(shù)為：分辨率48 μm，曝光時(shí)間800 ms，電壓80 kV，電流400 mA，圖像矩陣為4032×4032。掃描結(jié)束后，使用Inveon Research Workplace 分析軟件進(jìn)行各組大鼠的踝關(guān)節(jié)三維重建和分析。

2.6 血清PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6、NO 含量測(cè)定

取各組大鼠血清，采用ELISA 法檢測(cè)血清中PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量，采用比色法檢測(cè)血清中NO 的含量。

2.7 免疫組化法檢測(cè)踝關(guān)節(jié)組織中PPAR-γ、NFκB p65、p-NF-κB p65、COX-2、iNOS 的表達(dá)

各組大鼠切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，采用PBS 液代替一抗作陰性對(duì)照，細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，觀(guān)察整張切片，使用Image-pro Plus 軟件測(cè)量圖片積分光密度值（IOD）。高倍鏡下拍攝三個(gè)視野，將采集的圖像應(yīng)用Image-pro Plus 5.1 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)作免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性信號(hào)IOD，以IOD 值作為組織表達(dá)的定量標(biāo)準(zhǔn)，IOD ＝平均光密度（AOD）×陽(yáng)性面積（A）。

2.8 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（x±s），采用SAS 9.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。若各組數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析，兩組比較采用q檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布或方差不齊則采用非參數(shù)性檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

在初次免疫后第14 ～35日，CIA 模型組大鼠AI 評(píng)分逐漸升高，第42日略有降低；相較于模型組，芍甘附子湯各劑量組及雷公藤多苷片組在給藥2 周后（初次免疫后第28 ～42日）AI 評(píng)分均明顯降低（P＜0.05 或0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分的影響(x±s，n ＝12 ～15)Tab 1 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the AI score of CIA rats (x ±s，n ＝12 ～15)

3.2 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠血清PGE2、NO、TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響

與正常組比較，模型組血清中PGE2、NO、TNF-α、IL-1β、IL-6 含量升高（P＜0.01）。與模型組比較，芍甘附子湯各劑量組PGE2含量，芍甘附子湯低劑量組與雷公藤多苷片組NO，芍甘附子湯低、中劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 含量及雷公藤多苷片組TNF-α含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠血清PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6、NO 含量的影響(x±s，n ＝12 ～15)Tab 2 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the content of PGE2，TNF-α，IL-1β，IL-6，and NO in the serum of CIA rats (x ±s，n ＝12 ～15)

3.3 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠踝關(guān)節(jié)病理學(xué)的影響

正常組中滑膜大多內(nèi)襯單層上皮，個(gè)別兩三層，細(xì)胞排列規(guī)則，滑膜內(nèi)纖維間質(zhì)排列疏松，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；血管數(shù)量少，排列稀疏，為閉鎖狀態(tài)；軟骨平滑光整，細(xì)胞數(shù)量正常，潮線(xiàn)完整。

模型組中滑膜內(nèi)襯細(xì)胞層次增加，呈絨毛狀、乳頭狀肥大，滑膜內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)纖維組織增生；滑膜血管增生、擴(kuò)張，血管壁周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)；軟骨表面出現(xiàn)裂痕，細(xì)胞數(shù)量減少，潮線(xiàn)斷裂現(xiàn)象明顯。與正常組比較，模型組HE 病理評(píng)分顯著升高（P＜0.01）。

芍甘附子湯低、中劑量組中滑膜內(nèi)襯細(xì)胞層次較模型組減少，呈絨毛或乳頭狀，滑膜內(nèi)炎性細(xì)胞數(shù)目輕度減少，間質(zhì)纖維組織增生；滑膜血管增生，少量擴(kuò)張，血管壁周?chē)械攘垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)；軟骨表面不光滑，細(xì)胞變性，數(shù)量輕度減少，潮線(xiàn)模糊。芍甘附子湯高劑量組中滑膜內(nèi)襯細(xì)胞約為3 ～5 層，呈微小絨毛狀，滑膜內(nèi)炎性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，間質(zhì)纖維組織輕度增生；滑膜血管輕度增生，偶見(jiàn)擴(kuò)張，血管壁周?chē)倭垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)；軟骨表面不光滑，細(xì)胞數(shù)量輕度減少，潮線(xiàn)較清晰，有不延續(xù)現(xiàn)象。與模型組比較，芍甘附子湯中、高劑量組HE病理評(píng)分顯著降低（P＜0.05 或0.01）。

雷公藤多苷片組中滑膜內(nèi)襯細(xì)胞層次較模型組減少，呈小絨毛狀，滑膜內(nèi)炎性細(xì)胞數(shù)目減少，間質(zhì)纖維組織輕度增生；滑膜血管數(shù)目減少，血管壁周?chē)倭垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)；軟骨表面不光滑，細(xì)胞數(shù)量輕度減少，潮線(xiàn)較為模糊。與模型組比較，雷公藤多苷片組HE 病理評(píng)分顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3 及圖1。

圖1 芍甘附子湯對(duì)CIA 模型大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化的影響（HE，×50，n ＝6）Fig 1 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the ankle joint pathological changes of CIA model rats（HE，×50，n ＝6）

表3 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分的影響(x±s，n ＝6)Tab 3 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the pathological score of ankle joint in CIA rats (x±s，n ＝6)

3.4 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠踝關(guān)節(jié)影像學(xué)的影響

踝關(guān)節(jié)Micro CT 掃描發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠未出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹情況，皮質(zhì)骨光滑完整，骨態(tài)正常，骨質(zhì)均勻。模型組大鼠踝關(guān)節(jié)中重度腫脹，皮質(zhì)骨侵蝕破壞嚴(yán)重，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，關(guān)節(jié)面缺失，出現(xiàn)大量滑膜增生情況；趾關(guān)節(jié)腫脹嚴(yán)重甚至變形，關(guān)節(jié)面缺失與大量增生，關(guān)節(jié)之間的間隙有所變窄。芍甘附子湯低劑量組踝關(guān)節(jié)輕中度腫脹，皮質(zhì)骨見(jiàn)輕度不規(guī)則侵蝕破壞現(xiàn)象，關(guān)節(jié)間隙出現(xiàn)輕度變窄。芍甘附子湯中劑量組踝關(guān)節(jié)皮質(zhì)骨輕度侵蝕，表面輕度增生，關(guān)節(jié)之間的間隙變窄，脛骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨輕度疏松。芍甘附子湯高劑量組踝關(guān)節(jié)輕度腫脹，表面少量增生，關(guān)節(jié)輕度腫脹，關(guān)節(jié)之間的間隙輕度變窄，脛骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨輕度疏松。雷公藤多苷片組脛骨關(guān)節(jié)面出現(xiàn)輕度破壞，踝關(guān)節(jié)皮質(zhì)骨輕度破壞，邊緣毛刺，有少量增生，關(guān)節(jié)輕度腫脹，關(guān)節(jié)之間的間隙出現(xiàn)變窄現(xiàn)象（見(jiàn)圖2）。

圖2 芍甘附子湯對(duì)CIA 模型大鼠踝關(guān)節(jié)影像學(xué)的影響（CT 掃描，n ＝1）Fig 2 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the ankle joint imaging changes of CIA model rats（CT scan，n ＝1）

3.5 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜PPAR-γ、NF-κB p65、p-NF-κB p65、COX-2、iNOS 蛋白表達(dá)的影響

大鼠滑膜組織免疫組化結(jié)果顯示，PPAR-γ位于胞漿及胞核內(nèi)，呈黃色至棕黃色顆粒狀；COX-2 蛋白表達(dá)多位于細(xì)胞漿內(nèi)，iNOS 多位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿中，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色、棕褐色；NF-κB p65 位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)較多，且細(xì)胞核內(nèi)較細(xì)胞質(zhì)內(nèi)染色深且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多；p-NF-κB p65 多位于細(xì)胞核內(nèi)，陽(yáng)性狀態(tài)表現(xiàn)為黃色或棕黃色顆粒。正常組PPAR-γ可見(jiàn)其組織中的陽(yáng)性細(xì)胞分布十分密集，主要呈現(xiàn)出棕黃色狀態(tài)；模型組可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，且分布稀疏，顏色較淺呈淡黃色；芍甘附子湯各劑量組及雷公藤多苷片組陽(yáng)性細(xì)胞分布較為密集，顏色較深，呈棕黃色。相比于正常組，模型組PPAR-γ蛋白的IOD 值降低（P＜0.01）；與模型組比較，芍甘附子湯各劑量及雷公藤多苷片可明顯升高滑膜組織中PPAR-γ蛋白IOD 值（P＜0.05）。

正常組NF-κB p65、p-NF-κB p65、COX-2、iNOS 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞普遍分布較為稀疏，呈淺黃色且細(xì)胞數(shù)量較少；模型組可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞分布密集，呈棕黃色，顏色較深，胞體較大；芍甘附子湯各劑量組及雷公藤多苷片組顏色變淺，細(xì)胞分布較稀疏。與正常組比較，模型組組大鼠NF-κB p65、p-NF-κB p65、COX-2、iNOS 蛋白IOD 值顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，芍甘附子湯各劑量和雷公藤多苷片均可明顯降低滑膜組織中NF-κB p65、COX-2、iNOS 蛋白的IOD 值（P＜0.05）；芍甘附子湯高劑量組及雷公藤多苷片可降低滑膜組織中p-NF-κB p65 的IOD 值（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4 及圖3。

圖3 芍甘附子湯對(duì)CIA 模型大鼠踝關(guān)節(jié)PPAR-γ（a），NF-κB p65（b），p-NF-κB p65（c），COX-2（d）及INOS（e）表達(dá)的影響（免疫組化，×100，n ＝6）Fig 3 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the expression of PPAR-γ（a），NF-κB p65（b），p-NF-κB p65（c），COX-2（d），and INOS（e）in the ankle joint of CIA model rats（Immunohistochemistry，×100，n ＝6）

表4 芍甘附子湯對(duì)CIA 大鼠滑膜PPAR-γ、NF-κB p65、p-NF-κB p65、COX-2、iNOS 蛋白表達(dá)的影響(x±s，n ＝6，IOD)Tab 4 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the protein expression of PPAR-γ，NF-κB p65，p-NF-κB p65，COX-2，and iNOS in the ankle joint synovium of CIA rats (x±s，n ＝6，IOD)

4 討論

近年來(lái)，PPAR-γ/NF-κB p65 信號(hào)通路在RA發(fā)病機(jī)制中的作用受到許多學(xué)者關(guān)注。NF-κB 還作為多條通路的重要下游蛋白參與通路的激活，在氧化應(yīng)激、免疫炎癥以及細(xì)胞凋亡中起著重要作用，與RA 的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。NF-κB p65是NF-κB 亞基中最關(guān)鍵的亞基,其經(jīng)典激活途徑為在體內(nèi)由外界刺激或炎癥反應(yīng)等激活后，催化多種亞基和調(diào)節(jié)亞基形成多亞基激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）復(fù)合物，多聚體復(fù)合物首先發(fā)生磷酸化，使得NF-κB 的抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）活化，繼而泛素化后被降解，導(dǎo)致NF-κB 的二聚體復(fù)合物游離出細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞核與核內(nèi)特定的DNA 序列結(jié)合，調(diào)節(jié)參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子、趨化因子及黏附因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，進(jìn)而使病情加重[7-8]。臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，RA 患者及多種動(dòng)物模型如CIA、佐劑誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎等模型中的關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)存在NF-κB 的高度表達(dá)，與本研究中模型組的結(jié)果一致[9-12]。有學(xué)者通過(guò)建立CIA 大鼠模型，發(fā)現(xiàn)虎杖可通過(guò)對(duì)PPAR-γ/NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)，升高PPAR-γ并降低NF-κB p65 含量，降低通路中下游炎性因子的含量，減輕炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療RA 的目的[13]。本研究結(jié)果表明，芍甘附子湯可降低NF-κB p65 及其磷酸化水平，與文獻(xiàn)相關(guān)研究一致。

PPAR-γ在許多慢性炎癥性疾病及自身免疫性疾病中可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的減少NF-κB 的激活，抑制炎癥反應(yīng)，還可通過(guò)抑制多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生減輕滑膜炎癥及骨侵蝕情況，發(fā)揮其抗炎活性。已有研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ激動(dòng)劑可顯著增加PPAR-γ蛋白的表達(dá)，降低細(xì)胞因子及C-反應(yīng)蛋白水平，達(dá)到治療目的[14]。PPAR-γ對(duì)RA 的治療作用還與抑制滑膜細(xì)胞增殖及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的表型分化有關(guān)。臨床研究表明，PPAR-γ在人滑膜細(xì)胞中表達(dá)。并且，PPAR-γ激動(dòng)劑可抑制RA 滑膜細(xì)胞中相關(guān)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，減少骨吸收，促進(jìn)骨形成，還可調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖與凋亡過(guò)程[15]。經(jīng)PPAR-γ激動(dòng)劑刺激后可抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞中NF-κB 的表達(dá)[16]。PPAR-γ對(duì)RA 的影響還體現(xiàn)在可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的表型，通過(guò)抑制M1 巨噬細(xì)胞的極化，達(dá)到抗炎的目的。臨床數(shù)據(jù)顯示，RA 患者在接受常用藥物治療后，血清中PPAR-γ的表達(dá)顯著上升，表明其含量的高低與治療效果有關(guān)[17]。本研究中，PPAR-γ在模型組中為低表達(dá)，而進(jìn)行藥物干預(yù)后，其表達(dá)顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

iNOS 與COX-2 是NF-κB 信號(hào)通路重要的下游炎性介質(zhì)，NF-κB 被激活后會(huì)快速進(jìn)入細(xì)胞核與兩者的啟動(dòng)子區(qū)域的NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)iNOS 及COX-2 的生成。COX-2 是促進(jìn)花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素等具有生理活性的類(lèi)花生酸的重要催化物質(zhì)，在炎癥狀態(tài)下高表達(dá)，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等物質(zhì)的生成，導(dǎo)致新血管生成。本研究中，模型組中COX-2 及iNOS 蛋白的表達(dá)顯著升高，提示模型組大鼠存在明顯炎癥，而芍甘附子湯可顯著降低COX-2 及iNOS 蛋白的表達(dá)，表明芍甘附子湯具有一定的減輕炎癥反應(yīng)的作用。

PGE2是由多種免疫細(xì)胞分泌的促炎物質(zhì)，作為重要的炎性介質(zhì)在RA 的病情進(jìn)程中發(fā)揮重要的致炎作用，研究表明，COX-2 促進(jìn)新血管生成作用與PGE2有關(guān)。PGE2的過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)軟骨損傷，通過(guò)促進(jìn)滑膜組織軟骨細(xì)胞中膠原蛋白酶的產(chǎn)生，造成糖蛋白的合成與降解失衡，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞[18]。PGE2可調(diào)節(jié)IL-17 和TNF-α的表達(dá)，并調(diào)節(jié)TNF/IL-1 介導(dǎo)成纖維樣滑膜細(xì)胞活化，造成血管通透性的增強(qiáng)，炎癥因子釋放增多，最終導(dǎo)致促炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并放大增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。PGE2與其受體結(jié)合后還可增強(qiáng)RANKL的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的活化。本研究中芍甘附子湯可顯著降低PGE2的表達(dá)，表明芍甘附子湯可能對(duì)RA 有治療作用。

綜上，芍甘附子湯可改善CIA 大鼠關(guān)節(jié)腫脹及病理?yè)p害，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)PPAR-γ/NF-κB 信號(hào)通路，降低其下游COX-2、iNOS、PGE2、NO、TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達(dá)水平，從而達(dá)到治療RA 的目的，但具體作用環(huán)節(jié)和靶點(diǎn)尚待進(jìn)一步明確。