劉琪琪，王春柳，周潔，宗時(shí)宇，劉洋，張紅，李曄（.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 70003；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 72046）

肝臟疾病如病毒性肝炎、脂肪肝、肝纖維化、肝硬化、肝癌等在我國(guó)的發(fā)病率一直居高不下。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)有超過(guò)20%的人群受到肝臟疾病的困擾，尤其是乙肝、丙肝、肝硬化、肝癌、酒精性肝病和藥物性肝損傷等。開(kāi)展肝靶向給藥系統(tǒng)研究，將藥物定位、聚集于肝臟病變部位一直是臨床和基礎(chǔ)研究的關(guān)注點(diǎn)。甘草次酸（GA）為甘草的主要有效成分，大量研究表明，肝細(xì)胞膜上有大量與GA 相結(jié)合的位點(diǎn)，是天然的肝靶向遞藥系統(tǒng)的修飾分子[1-2]。

脂質(zhì)-聚合物雜化納米粒（LPHNPs）是一類基于脂質(zhì)體和聚合物納米粒發(fā)展的新型載藥系統(tǒng)，在靶向給藥方面優(yōu)勢(shì)獨(dú)特[3-6]，其核殼結(jié)構(gòu)兼具聚合物納米粒的剛性與磷脂結(jié)構(gòu)的柔性，且易于修飾，具有廣泛的應(yīng)用前景。芍藥苷（Pae）是中藥芍藥的主要有效成分，已有研究表明，芍藥苷在脂肪肝、肝纖維化、肝腫瘤中均有顯著療效[7-9]。

本文制備了一種載芍藥苷的甘草次酸介導(dǎo)的脂質(zhì)-聚合物雜化肝靶向給藥系統(tǒng)（GA-LPHNPs-Pae），并對(duì)其進(jìn)行體外理化性質(zhì)表征和基于體外細(xì)胞模型的初步靶向性驗(yàn)證，可為新型中藥肝靶向藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（MD-1000D，南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司）；激光粒度分析儀（ZEN3600，馬爾文儀器）；數(shù)顯多頭磁力恒溫?cái)嚢杵鳎℉J-6B，金壇市城東盛聯(lián)實(shí)驗(yàn)儀器廠）；精密電子天平（BT125D）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA）（上海亞榮生化儀器廠）；光學(xué)顯微鏡（CKX31，日本奧林巴斯）；二氧化碳培養(yǎng)箱（3111，Thermo 公司）；激光共聚焦掃描顯微鏡（TCS MP5，LEICA）；傅里葉變換紅外光譜儀（Tensor27，Bruker 公司）。

芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201943，純度：95.7%，成都克洛瑪生物科技有限公司），PEG-PLGA、GA-DSPE-PEG、大豆卵磷脂（西安瑞希生物科技有限公司），聚乙烯醇（PVA，Mn ＝13 000 ～23 000， 美國(guó)Sigma Aldrich 公司），葡聚糖凝膠G-50（長(zhǎng)征制藥廠），HepG2細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)），DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：ME100202P1）、 胎牛血清（批號(hào)：10099-141）、胰酶消化液（批號(hào)：25200-056）、青鏈霉素雙抗混合液（批號(hào)：15140）（GIBCO），DAPI（1∶2000，上海碧云天生物技術(shù)研究所），F(xiàn)ITC（95%，美倫生物），甲醇（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司），無(wú)水乙醇、乙酸乙酯及其他試劑為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 GA-LPHNPs-Pae 制備

以大豆卵磷脂、GA-DSPE-PEG、膽固醇作為殼層材料，以PEG-PLGA 為核層材料，采用兩步法制備GA-LPHNPs-Pae，其中內(nèi)核層采用復(fù)乳法制備。

精密稱取PEG-PLGA 聚合物適量置于西林瓶中，加入乙酸乙酯5 mL 溶解。稱取適量芍藥苷，加水配至質(zhì)量濃度為500 mg·mL－1，移液器移取0.5 mL 超聲分散于有機(jī)相中，采用細(xì)胞破碎儀300 W 功率超聲乳化3 min，形成油包水（W/O）型初乳，在1500 r·min－1磁力攪拌下將初乳緩慢滴加到1% PVA 分散液中，冰浴下繼續(xù)采用細(xì)胞破碎儀乳化2 min，在1000 r·min－1磁力攪拌6 h 以除去有機(jī)溶劑，即得NPs-Pae 分散液。

取一定量蛋黃卵磷脂、GA-DSPE-PEG、膽固醇以適量乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，40℃減壓去除溶劑至內(nèi)壁形成均勻脂質(zhì)膜，采用10 mL NPs-Pae 分散液在60℃水化30 min，取出采用細(xì)胞破碎儀100 W 功率超聲3 min，即得GALPHNPs-Pae 粗分散液。

2.2 GA-LPHNPs-Pae 粒徑分布與電位分析

分別取NPs-Pae 和GA-LPHNPs-Pae 溶液適量，經(jīng)蒸餾水稀釋10 倍后進(jìn)行Zeta 電位測(cè)定，稀釋100 倍后測(cè)定粒徑分布，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 粒徑與分布Fig 1 Particle size and distribution

NPs-Pae 的粒徑、分散指數(shù)和Zeta 電位分別為（90.27±1.99）nm、（0.115±0.001）、（－6.78±1.70）mV，表明納米粒的粒徑大小均一、整個(gè)體系比較穩(wěn)定。

GA-LPHNPs-Pae 的粒徑、分散指數(shù)和Zeta電位分別為（96.98±0.39）nm、（0.104±0.005）、（－13.10±0.26）mV，表明經(jīng)過(guò)修飾后的納米粒粒徑稍有增大，分布較窄，電位絕對(duì)值有增加，整個(gè)體系更加穩(wěn)定。

2.3 GA-LPHNPs-Pae 紅外分析[4，10]

采用KBr 壓片法，將 NPs-Pae、GA-LPHNPs-Pae 和GA-DSPE-PEG 粉末樣品分別與溴化鉀1∶100 混合研磨至均勻，壓成透明的薄片，在400 ～4000 cm－1內(nèi)記錄樣品骨架紅外振動(dòng)吸收峰，測(cè)試分辨率為 4 cm－1，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2 可知，與NPs-Pae 相比，GA-DSPE-PEG和GA-LPHNPs-Pae 在1250 cm－1處有一銳利小峰，為羧基中的羥基峰峰位，雖然3 個(gè)樣本中均有羥基存在，但PEG 中的羥基為聚合狀態(tài)，而GA 中羥基屬為游離態(tài)；另外，在指紋區(qū)690 cm－1峰位處，GADSPE-PEG 和GA-LPHNPs-Pae 較NPs-Pae 多出一個(gè)銳利小峰，可能為GA 結(jié)構(gòu)中C 環(huán)和D 環(huán)共有13號(hào)碳的三取代的特征峰位，上述兩處峰位對(duì)比說(shuō)明GA-LPHNPS-Pae 表面修飾了具有游離羥基的GA。

圖2 紅外分析圖Fig 2 IR analysis diagram

2.4 GA-LPHNPs-Pae 包封率測(cè)定

由于LPHNPs 外層殼層屬于柔性結(jié)構(gòu)，不適合采用高速離心法、超濾法等強(qiáng)烈機(jī)械力涉及的方法，因此，本項(xiàng)目中采用葡聚糖凝膠柱法[11]進(jìn)行包封率測(cè)定。

2.4.1 芍藥苷HPLC 測(cè)定條件

① 色譜條件：C18色譜柱，以乙腈-0.1% 磷酸溶液（14∶86）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 mm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫為30℃。

② 線性關(guān)系考察：取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL 含60 μg 的溶液，作為母液。精密吸取適量芍藥苷母液配制成質(zhì)量濃度為4.12、6.18、8.24、12.36、16.48、20.6 μg·mL－1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)樣分析，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量回歸分析作圖，得到芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝1.024×104X＋368.3，r＝0.9997，表明進(jìn)樣量在0.0206 ～0.206 μg 與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

③ 洗脫液測(cè)定樣品處理方法：收集包封率樣品于玻璃試管中，加入3 倍量二氯甲烷，渦旋混合1 min，待分層徹底后，分離下層水層，再加入3 倍量二氯甲烷，同法萃取后，棄去二氯甲烷層，水層采用0.22 μm 針孔濾器濾過(guò)，續(xù)濾液進(jìn)行含量測(cè)定分析。

2.4.2 葡聚糖凝膠柱洗脫曲線建立 稱取適量葡聚糖G-50 作為固定相，溶脹好之后濕法填入10 mL 一次性注射器，洗脫約10 個(gè)柱體積后，移液器吸取上樣液0.5 mL，輕輕上樣至凝膠柱頂部，以純化水洗脫，1.5 mL EP 管依次接取洗脫液，每0.5 mL 一管，采用“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣本濃度，以樣品管編號(hào)為橫坐標(biāo)，以芍藥苷濃度為縱坐標(biāo)作圖，分別繪制Pae 游離藥物及GA-LPHNPS-Pae 洗脫曲線，見(jiàn)圖3。納米粒子在7 ～14 管被首先洗出，游離藥物在17 ～31 管洗出，粒子和游離藥物基本達(dá)到分離。

圖3 GA-LPHNPs-Pae 葡聚糖凝膠柱分離洗脫曲線Fig 3 Elution curve of gel column separation of GA-LPHNPs-Pae

2.4.3 包封率測(cè)定

① 總藥物量：取0.5 mLGA-LPHNPs-Pae 分散液，稀釋至線性范圍內(nèi)，進(jìn)樣測(cè)定，通過(guò)Pae標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中所含有的Pae 藥物質(zhì)量作為總藥量WT。

② 包封藥量：收集GA-LPHNPs-Pae 分散液，上樣洗脫第7 ～14 管樣本測(cè)定，通過(guò)Pae 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中所含有的Pae 藥物質(zhì)量作為包封藥量，記為WE。

③ 包封率測(cè)定樣品制備：收集包封率樣品于玻璃試管中，加入3 倍量二氯甲烷，渦旋混合1 min，待分層徹底后，分離下層水層，再加入3倍量二氯甲烷，同法萃取后，棄去二氯甲烷層，水層采用0.22 μm 針孔濾器濾過(guò)，續(xù)濾液進(jìn)行含量測(cè)定分析，根據(jù)以下公式計(jì)算包封率：

包封率＝We/Wt×100%[注：We為包封的藥物的質(zhì)量（mg），Wt為體系中藥物總質(zhì)量]。

測(cè)定3 批GA-LPHNPs-Pae 包封率結(jié)果分別為41.6%、52.3%、48.6%，平均包封率為（47.5±5.4）%。

2.5 GA-LPHNPs-Pae 釋放度測(cè)定

取各組聚合物納米粒1 mL，加入到3kD透析袋中，置于40 mL pH 7.4 PBS，再置于（37±0.5）℃恒溫震蕩搖床中，分別于0、2、4、8、12、24、36、48、72 h 取樣2 mL，同時(shí)補(bǔ)給等體積的釋放介質(zhì)。使用HPLC 法測(cè)定樣品溶液中芍藥苷的含量，計(jì)算釋放度，并繪制累積釋放曲線，見(jiàn)圖4。

圖4 GA-LPHNPs-Pae 體外釋放度Fig 4 In vitro drug release of Pae in GA-LPHNPs

由圖4 可知，在24 h 內(nèi)GA-LPHNPs-Pae 中芍藥苷釋放呈現(xiàn)先快后慢趨勢(shì)，在前2 h 內(nèi)，GALPHNPs-Pae 可釋放出約50%藥量，在2 ～12 h內(nèi)釋放速度顯著下降，曲線平緩，12 h 后釋放曲線基本平衡，但絕對(duì)藥量并未達(dá)到100%釋放?；贚PHNPs 的核-殼結(jié)構(gòu)推測(cè)，在前2 h 快速釋放的，可能在初期釋放的是外脂質(zhì)層包封的藥物，內(nèi)核聚合物材料中藥物則釋放較緩慢。

2.6 GA-LPHNPs-Pae 體外靶向性評(píng)價(jià)[12]

2.6.1 孵化時(shí)間的考察 以FITC 為熒光探針，與芍藥苷一起載入NPs-Pae 和GA-LPHNPs-Pae中，制備帶熒光的納米粒樣品，葡聚糖凝膠柱純化后冷凍干燥，用HBSS 充分溶解至藥物當(dāng)量為50 μg·mL－1。

HepG2 細(xì)胞以1×105個(gè)·cm－2密度接種于涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，于24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 ～48 h。細(xì)胞用HBSS 溶液預(yù)先孵育15 min后，每孔加入0.5 mL，放入培養(yǎng)箱中分別孵育1、2、4 h，考察孵化時(shí)間對(duì)結(jié)果影響。孵育結(jié)束后，吸棄納米粒溶液，PBS 沖洗3 次，取出玻片放入4%多聚甲醛中，于室溫固定20 min，PBS 漂洗3次，DAPI 染色10 min，以磷酸甘油封片，以不加納米粒的細(xì)胞為空白對(duì)照，激光共聚焦觀察。結(jié)果如圖5（其中藍(lán)色為細(xì)胞核顏色，綠色為FITC熒光顏色）。GA-LPHNPs-Pae 可被HepG2 細(xì)胞攝取，且胞內(nèi)熒光強(qiáng)度2 h 較1 h 明顯增強(qiáng)，4 h 與2 h 相比略弱。因此，確定孵化時(shí)間為2 h。

圖5 兩種納米粒孵育HepG2 細(xì)胞不同時(shí)間的攝入情況Fig 5 Uptake of two nanoparticles incubating HepG2 cells at different times

2.6.2 細(xì)胞攝取納米粒的定性觀察 取50 μg·mL－1的NPs-Pae 和GA-LPHNPs-Pae 分 散液，按照“2.6.1”項(xiàng)下方法孵化2 h 后進(jìn)行細(xì)胞攝取定性考察，結(jié)果如圖6 所示。在2 h 時(shí)間點(diǎn)GA-LPHNPs-Pae 組熒光強(qiáng)度明顯大于NPs-Pae，表明GA-LPHNPs-Pae 較未修飾的NPs-Pae 更易于被肝細(xì)胞攝取，從體外細(xì)胞模型中驗(yàn)證了GALPHNPs-Pae 的肝靶向性。

圖6 兩種納米粒孵育2 h HepG2 細(xì)胞攝取定性Fig 6 Uptake characterization of two nanoparticles incubating HepG2 cells for 2 h

3 討論

在GA-LPHNPs-Pae 處方優(yōu)化時(shí)候發(fā)現(xiàn)，水溶性藥物在GA-LPHNPs 遞藥系統(tǒng)中載藥有限，整體包封率效率未達(dá)到80%，原因可能是因?yàn)镻ae 水溶性很強(qiáng)，與有機(jī)聚合物材料親和性不強(qiáng)導(dǎo)致[13-14]。對(duì)納米粒乳化體系篩選、工藝優(yōu)化反復(fù)摸索，最終確定本研究中所用的聚合物材料乳化體系，所得到最優(yōu)包封率在50%。通過(guò)本項(xiàng)目的實(shí)施發(fā)現(xiàn)，聚合物納米粒構(gòu)建過(guò)程中，不同藥物在不同乳化體系、不同聚合物材料中的物理化學(xué)相容性對(duì)于處方優(yōu)化非常重要，因此針對(duì)此方向開(kāi)展的工作具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)于GA-LPHNPs-Pae 中藥物包封率的測(cè)定也是一個(gè)值得探索的問(wèn)題。通常納米材料包封率測(cè)定方法有葡聚糖凝膠柱法、超濾離心法、高速離心法[15-16]。對(duì)于聚合物納米粒可選用超濾離心法或高速離心法，而脂質(zhì)體由于其結(jié)構(gòu)柔軟性則多采用葡聚糖凝膠柱法，脂質(zhì)聚合物雜化納米粒集合了聚合物納米粒的硬度和脂質(zhì)體的柔軟性，在實(shí)驗(yàn)中綜合考慮采用了葡聚糖凝膠柱法，以防止破壞殼-核結(jié)構(gòu)[17-19]。

本文制備了GA-LPHNPs-Pae，并對(duì)其藥劑學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步理化評(píng)價(jià)，在體外采用細(xì)胞模型進(jìn)行了初步靶向性評(píng)價(jià)，本課題研究的脂質(zhì)聚合物雜化納米粒是一個(gè)復(fù)雜體系，分為內(nèi)外兩部分：內(nèi)核的載藥PEG-PLGA 聚合物納米粒是經(jīng)復(fù)乳法制得，殼層經(jīng)水化法包被帶GA 修飾的磷脂（GADSPE-PEG）[20]，目前暫未對(duì)GA 的表面修飾進(jìn)行詳細(xì)的研究，但課題組認(rèn)為通過(guò)后續(xù)的細(xì)胞靶向攝取結(jié)果也可以間接證實(shí)GA 的表面修飾，并且會(huì)進(jìn)一步有效證明靶向修飾[21]。在今后的研究中，本課題組將繼續(xù)對(duì)GA-LPHNPs-Pae 的體內(nèi)靶向性進(jìn)行驗(yàn)證，為新型肝靶向藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。