劉春陽(yáng) 王彥輝 方多多 賈 慧 丁 毅 王雷永

(1 北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院瘡瘍血管外科，北京市 101300；2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院瘡瘍血管外科，北京市 100010)

我國(guó)糖尿病患病率為10.4%，下肢外周動(dòng)脈病變(peripheral artery disease，PAD)是糖尿病常見的、嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥。動(dòng)脈粥樣硬化是下肢PAD的主要病理改變，易造成下肢血管的狹窄與閉塞；下肢PAD的致死率和致殘率均較高，是糖尿病足潰瘍及截肢的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1-2]。miRNA是一類非編碼RNA分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、增殖等多種生理過程，目前已發(fā)現(xiàn)miRNA與多種心血管疾病(如下肢PAD)的發(fā)生有關(guān)[3]。研究表明，miR-130a-3p在冠心病患者血漿中的表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度呈負(fù)相關(guān)，可作為評(píng)估冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的潛在生物標(biāo)志物[4]。胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)不僅具有調(diào)節(jié)血糖、血脂的作用，還可增加機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，刺激血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中發(fā)揮重要作用[5]。研究表明，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)并發(fā)下肢PAD的患者IGF-1表達(dá)水平升高，IGF-1高表達(dá)是T2DM患者并發(fā)下肢PAD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]。本研究通過檢測(cè)T2DM患者血清中miR-130a-3p及IGF-1的表達(dá)情況，探討二者對(duì)T2DM并發(fā)下肢PAD的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年10月至2020年12月在北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院瘡瘍血管外科就診的178例T2DM患者作為研究對(duì)象，其中男性96例、女性82例，患者年齡50～79(54.00±8.50)歲。根據(jù)入院時(shí)的踝臂指數(shù)[7]判斷患者是否并發(fā)下肢PAD，然后將患者分為單純T2DM組90例(踝臂指數(shù)>0.90)和并發(fā)PAD組88例(踝臂指數(shù)≤0.90)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2013版)》[8]中T2DM及糖尿病所致下肢PAD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)肝腎功能正常，無(wú)其他器質(zhì)性疾?。?3)患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)1型糖尿?。?2)合并高血壓、心肌梗死、心力衰竭、腦血管疾病、內(nèi)分泌疾病的患者；(3)近3個(gè)月內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素治療者；(4)臨床資料不全者。本研究通過該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 TRIzol提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司(批號(hào)：15596026)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司(批號(hào)：RR036A、RR820A)；miR-130a-3p及U6的引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)與合成。ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。IGF-1 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Elabscience公司(批號(hào)：E-EL-H0086c)。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料的收集：收集所有患者的一般資料及入院時(shí)未接受治療前的血清學(xué)指標(biāo)。一般資料包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)及病程等。血清學(xué)指標(biāo)包括空腹血糖、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)、餐后2 h血糖(2-hour postprandial blood glucose,2hPBG)、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、三酰甘油、總膽固醇、HDL-C、LDL-C等指標(biāo)。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗(homeostasis model-insulin resistance，HOMA-IR)指數(shù)，HOMA-IR指數(shù)=空腹血糖×FINS/22.5。

1.3.2 踝臂指數(shù)的測(cè)量：于患者入院時(shí)未接受治療前進(jìn)行測(cè)量。取仰臥位，采用彩色多普勒血流探測(cè)儀(日本林電氣株式會(huì)社，型號(hào)ES-100V3)測(cè)量雙側(cè)前臂肱動(dòng)脈收縮壓，以最高值為肱動(dòng)脈壓，然后測(cè)量與肱動(dòng)脈收縮壓同側(cè)的脛后動(dòng)脈和足背動(dòng)脈收縮壓，以最高值為踝動(dòng)脈壓。計(jì)算踝臂指數(shù)，踝臂指數(shù)=肱動(dòng)脈壓/踝動(dòng)脈壓。

1.3.3 樣品采集及保存：于入院時(shí)未治療前，采集患者清晨空腹肘靜脈血5 mL，裝入試管，2 000～3 000 r/min離心10 min，收集上清液，保存于-80 ℃冰箱。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清miR-130a-3p表達(dá)水平：使用TRIzol試劑提取血清中的總RNA，采用NanoDrop 2000c微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司)檢測(cè)總RNA的濃度及純度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組患者血清miR-130a-3p表達(dá)水平。miR-130a-3p基因和U6基因引物序列見表1。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，包括SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL、滅菌蒸餾水6 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃、45 s，65 ℃、15 s，72 ℃、15 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后，以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt分析法計(jì)算miR-130a-3p的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.3.5 ELISA檢測(cè)血清IGF-1表達(dá)水平：采用ELISA試劑盒檢測(cè)兩組患者的血清IGF-1表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson法分析血清miR-130a-3p、IGF-1表達(dá)水平與踝臂指數(shù)的相關(guān)性；采用Logistic回歸分析影響T2DM患者并發(fā)下肢PAD的危險(xiǎn)因素，采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評(píng)價(jià)血清miR-130a-3p、IGF-1表達(dá)水平對(duì)T2DM患者并發(fā)下肢PAD的診斷價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者臨床資料的比較 兩組患者的空腹血糖、HbA1c、2hPBG、三酰甘油、FINS、HOMA-IR指數(shù)及踝臂指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；兩組患者的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、病程、總膽固醇、HDL-C、LDL-C比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 兩組患者臨床資料的比較

2.2 兩組患者血清miR-130a-3p、IGF-1表達(dá)水平的比較 并發(fā)PAD組患者血清miR-130a-3p表達(dá)水平低于單純T2DM組，IGF-1表達(dá)水平高于單純T2DM組(均P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者血清miR-130a-3p相對(duì)表達(dá)水平和IGF-1表達(dá)水平的比較(x±s)

2.3 并發(fā)下肢PAD患者血清miR-130a-3p、IGF-1表達(dá)水平與踝臂指數(shù)的相關(guān)性 并發(fā)PAD組患者血清miR-130a-3p表達(dá)水平與踝臂指數(shù)呈正相關(guān)性(r=0.405，P<0.001)，血清IGF-1表達(dá)水平與踝臂指數(shù)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.533，P<0.001)。

2.4 血清miR-130a-3p、IGF-1表達(dá)水平對(duì)T2DM患者并發(fā)下肢PAD的診斷價(jià)值 血清miR-130a-3p表達(dá)水平診斷T2DM患者并發(fā)下肢PAD的曲線下面積為0.857(95%CI：0.797，0.905；P<0.001)，截?cái)嘀禐?.71時(shí)敏感度為82.95%，特異度為85.56%。IGF-1表達(dá)水平診斷T2DM患者并發(fā)下肢PAD的曲線下面積為0.832(95%CI：0.768，0.883；P<0.001)，截?cái)嘀禐?62.63 ng/mL時(shí)敏感度為84.09%，特異度為75.59%。血清miR-130a-3p與IGF-1表達(dá)水平聯(lián)合診斷T2DM患者并發(fā)下肢PAD的曲線下面積為0.923(95%CI：0.873，0.957；P<0.001)，截?cái)嘀禐?.383時(shí)敏感度為89.77%，特異度為84.44%，見圖1。

圖1 血清miR-130a-3p、IGF-1表達(dá)水平對(duì)T2DM患者并發(fā)下肢PAD的診斷價(jià)值

2.5 T2DM患者并發(fā)下肢PAD影響因素的Logistic回歸分析 以T2DM患者是否并發(fā)下肢PAD為因變量(是=1，否=0)，以表2及表3中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)為自變量(根據(jù)ROC曲線的截?cái)嘀颠M(jìn)行賦值：miR-130a-3p表達(dá)水平≤0.71=1，miR-130a-3p表達(dá)水平>0.71=0；IGF-1表達(dá)水平>162.63 ng/mL=1，IGF-1表達(dá)水平≤162.63 ng/mL=0，其余變量以實(shí)測(cè)值納入)，納入Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，空腹血糖、HbA1c、三酰甘油水平及IGF-1表達(dá)水平升高，以及miR-130a-3p表達(dá)水平降低是T2DM患者并發(fā)下肢PAD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，見表4。

表4 T2DM患者并發(fā)下肢PAD影響因素的Logistic回歸分析

3 討 論

下肢PAD是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，動(dòng)脈粥樣硬化是其主要病理基礎(chǔ)，研究表明胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝異常、持續(xù)高血糖、炎癥反應(yīng)等均是下肢PAD發(fā)生的危險(xiǎn)因素[9-10]。下肢PAD患者因?yàn)橄轮毖?，可出現(xiàn)肢體壞疽、截肢等嚴(yán)重不良后果，這嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此尋找影響下肢PAD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，對(duì)下肢PAD的預(yù)防和治療具有重要意義。

研究表明，miRNA在血管重塑、微血管病變、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及糖尿病血管病變中均起到重要作用[11]。miR-130a-3p為miRNA的一種類型，在代謝相關(guān)疾病和心血管疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[12]。盧翔等[13]的研究表明，過表達(dá)miR-130a可改善T2DM患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的黏附和遷移能力，并可抑制白細(xì)胞介素18、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的表達(dá)。王曉姣等[14]的研究表明，過表達(dá)的miR-130a-3p可能通過抑制蛋白激酶通路來減輕H9c2心肌細(xì)胞的肥大程度。另有研究表明，miR-130a-3p在血管生成過程中發(fā)揮重要作用，其在神經(jīng)發(fā)育過程中調(diào)控感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2的表達(dá)[15]。本研究結(jié)果顯示，與單純T2DM組比較，并發(fā)PAD組患者血清miR-130a-3p表達(dá)水平降低(P<0.05)，提示miR-130a-3p表達(dá)水平與下肢PAD的發(fā)生有關(guān)。

IGF-1是一種胰島素類似物，具有促生長(zhǎng)作用。其主要由肝臟合成和分泌，不僅具有調(diào)節(jié)血糖、血脂的作用，還可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖，在動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄等心血管疾病中發(fā)揮重要作用[16-17]。IGF-1可與其受體結(jié)合形成復(fù)合物沉積在血管壁上，促進(jìn)血管細(xì)胞增殖、分化以使得血管中膜增厚，導(dǎo)致血管管腔狹窄，從而引發(fā)微血管病變和大血管病變。Lin等[18]的研究表明，IGF-1可通過激活磷脂?；?-激酶/蛋白激酶信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞/脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)體系的血管生成，從而促進(jìn)新生血管形成。沈?qū)庩?yáng)等[19]發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者血清IGF-1表達(dá)水平升高，IGF-1表達(dá)水平與糖尿病腎病患者發(fā)生腎微血管病變有關(guān)，是腎微血管病變的危險(xiǎn)因素。還有研究表明，高IGF-1表達(dá)水平的肥胖型糖尿病患者的血糖、血脂及左心室射血分?jǐn)?shù)水平均明顯低于低IGF-1表達(dá)水平者，且高IGF-1表達(dá)水平患者胰島素抵抗程度低，表明血清IGF-1表達(dá)水平與糖尿病患者的糖脂代謝和心功能密切相關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，并發(fā)PAD組患者血清IGF-1表達(dá)水平高于單純T2DM組(P<0.05)，這與李倩[6]的研究結(jié)果一致，表明IGF-1表達(dá)水平升高與下肢PAD有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，并發(fā)PAD組患者血清miR-130a-3p表達(dá)水平與踝臂指數(shù)呈正相關(guān)性，血清IGF-1表達(dá)水平與踝臂指數(shù)呈負(fù)相關(guān)性(均P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了血清miR-130a-3p、IGF-1表達(dá)水平與下肢PAD相關(guān)。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清miR-130a-3p表達(dá)水平降低、IGF-1表達(dá)水平升高是影響T2DM患者并發(fā)下肢PAD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，提示miR-130a-3p、IGF-1或許可作為診斷T2DM患者并發(fā)下肢PAD的標(biāo)志物。ROC曲線分析顯示，血清miR-130a-3p、IGF-1表達(dá)水平單獨(dú)或聯(lián)合診斷T2DM患者并發(fā)下肢PAD曲線下面積分別為0.857、0.832、0.923，提示血清miR-130a-3p、IGF-1表達(dá)水平對(duì)T2DM患者并發(fā)下肢PAD具有一定的診斷價(jià)值，二者聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步提高診斷效能。

綜上所述，T2DM并發(fā)下肢PAD的患者血清中miR-130a-3p呈低表達(dá)、IGF-1呈高表達(dá)，二者與下肢PAD的發(fā)生密切相關(guān)，二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)T2DM患者并發(fā)下肢PAD具有一定的診斷價(jià)值。