吳雪燕 張梅 王星星 焦薇△

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001，2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004)

宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)是與宮頸癌(CC)密切相關(guān)的一組病變。目前國際公認(rèn)高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的持續(xù)感染是CIN或CC發(fā)生的必要條件[1-2]。從HPV感染到發(fā)展為CIN及癌變大概需要5～10年，目前認(rèn)為陰道微環(huán)境在宮頸HPV感染、宮頸上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生、發(fā)展存在過程中發(fā)揮作用[3-4]。本文主要探討陰道菌群的改變與不同級別宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年7月至2020年1月就診于貴州醫(yī)科大學(xué)婦科門診的高危型HPV感染患者，以陰道鏡下活檢病理結(jié)果為依據(jù)分為三組，其中正常組25例，年齡24～55歲，平均(35.88±8.20)歲，低級別宮頸上皮內(nèi)瘤變組11例，年齡21～42歲，平均(33.18±6.66)歲，高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變組29例，年齡28～50歲，平均(39.17±6.09)歲。納入患者均為年齡18～55歲的已婚女性，月經(jīng)周期規(guī)律，1個月內(nèi)無陰道用藥史、全身使用使用抗生素史；1周內(nèi)無陰道不規(guī)則流血史；3 d內(nèi)無性生活史。已排除妊娠期、哺乳期、月經(jīng)期、絕經(jīng)期婦女；陰道炎患者；有宮頸病變治療史婦女；宮內(nèi)節(jié)育器置入術(shù)后患者；長期使用皮質(zhì)類固醇激素、免疫抑制劑婦女；糖尿病、心、肝、腎等內(nèi)科疾病患者。各組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法 標(biāo)本采集前告知研究對象本實驗研究方案及意義，獲其同意后，采集陰道分泌物，30 min內(nèi)保存至-80℃冰箱中。通過16S rDNA測序技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取、擴(kuò)增、測序：采用提取試劑盒 QIAamp DNA Mini Kit對陰道分泌物進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取。繼而進(jìn)行PCR擴(kuò)增：試劑盒中提供P1、P3、P5、P6 四對擴(kuò)增引物，按照P1+P5、P3+P6引物對組合配置PCR反應(yīng)體系。最后參照Illumina Miseq 默認(rèn)流程進(jìn)行上機(jī)操作、參數(shù)設(shè)置步驟，完成每個樣本測定20萬對以上序列的數(shù)據(jù)。

1.3觀察指標(biāo) 陰道菌群多樣性是指某一菌群中所有細(xì)菌種類的多少，是評價陰道微環(huán)境的一個重要指標(biāo)。優(yōu)勢菌群是指菌群中生物量或種群密集度最大的細(xì)菌，在很大程度上影響著整個菌群的功能且其對宿主的生理病理影響最大。對三組菌群多樣性及優(yōu)勢菌群進(jìn)行對比分析。

2 結(jié) 果

2.1菌群多樣性分析 微生物群落結(jié)構(gòu)是按照界、門、綱、目、科、屬、種水平逐級分層，本實驗共檢出26種菌種，隨著宮頸病變的發(fā)生發(fā)展，在菌種水平各組間陰道菌群多樣性無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。分別在菌屬和菌門水平再次進(jìn)行菌群多樣性比較，均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

表1 不同組別陰道菌群多樣性的比較

2.2優(yōu)勢菌群分析 本實驗結(jié)果前三位陰道優(yōu)勢菌為惰性乳桿菌、卷曲乳桿菌、阿托波氏菌，惰性乳桿菌在三組中檢出率高達(dá)46.15%(30/65)。各組優(yōu)勢菌群之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。各優(yōu)勢菌群在每組中的構(gòu)成比詳見表1。

表2 不同組優(yōu)勢菌群在每組中的構(gòu)成比的比較[n(%)]

3 討 論

陰道微生物在HPV感染的持續(xù)或消退中起到重要作用[3,5-6]，但在宮頸上皮內(nèi)瘤變的女性中陰道微環(huán)境作用的研究相對較少。我們分別在菌種水平、菌屬水平以及菌門水平分析不同級別宮頸病變患者陰道菌群多樣性之間的差異，結(jié)果均提示無統(tǒng)計學(xué)意義。C.J.Piyathilake等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變分級升高，陰道菌群的多樣性并無增加。通過本次研究我們發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變嚴(yán)重程度的增加，以卷曲乳桿菌為優(yōu)勢菌群的占比明顯減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。惰性乳桿菌在各組中的占比呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，從我們的數(shù)據(jù)分析各組優(yōu)勢菌群之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這一結(jié)果與A.Mitra等[8]研究一致。我們推測高危型HPV感染患者，陰道菌群以惰性乳桿菌為主，且隨著宮頸病變的發(fā)展，惰性乳桿菌的占比逐漸升高；盡管在樣本量不大的情況下分析結(jié)果沒有顯著性差異，但我們考慮卷曲乳桿菌為主的陰道菌群的減少與疾病嚴(yán)重程度增加之間可能存在相關(guān)性。下一步需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步分析優(yōu)勢菌群與宮頸病變的關(guān)系。