李恒 張東輝 劉丹璐

(西安市中心醫(yī)院結(jié)直腸外科，陜西 西安 710001)

結(jié)腸癌位居胃腸道腫瘤發(fā)病率的第三位，嚴重威脅人類生存健康。目前結(jié)腸癌首選的治療手段仍是以手術(shù)為主的綜合治療，但存在約35%的患者術(shù)后出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況，嚴重影響結(jié)腸癌患者的總體治愈率[1]。因此，早日明確結(jié)腸癌特異性腫瘤標記物，結(jié)合臨床個體化治療，最終達到減少結(jié)腸癌患者病死率的目的，是醫(yī)務(wù)工作者目前急需解決的棘手問題。研究[2]發(fā)現(xiàn)細胞角蛋白19(CK19)敏感性較高，其可在上皮性腫瘤組織中高表達，而在正常外周血、淋巴結(jié)等非上皮組織中低表達。同時，也有研究[3]發(fā)現(xiàn)CK19可能參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，但其具體機制尚未明確。因此，本研究旨在探討結(jié)腸癌術(shù)后感染患者外周血中CK19 mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白表達的意義，并分析CK19 mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白表達情況與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2011年1月至2019年1月我院收治的結(jié)腸癌術(shù)后感染患者80例作為觀察組，另選取同期我院收治的結(jié)腸息肉患者80例作為對照組。所有患者均經(jīng)相關(guān)病理學診斷，臨床資料完整，患者及家屬對本研究內(nèi)容均知情同意，且所有患者術(shù)前均未接受放療、化療等；排除合并嚴重心、肝、腎等器質(zhì)性疾病的患者，及合并其他內(nèi)外科疾病和其他腫瘤疾病的患者等。其中觀察組男52例，女28例；年齡42～68歲，平均(45.52±2.81)歲；病程0.5～3年，平均(1.42±1.21)年。對照組男54例，女26例；年齡40～67歲，平均(43.68±1.82)歲；病程0.5～3.5年，平均(1.98±1.51)年。兩組患者的主要臨床一般資料比較無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核并通過。

1.2主要試劑及儀器 總RNA提取試劑盒(北京康為世紀公司)、cDNA合成試劑盒(北京康為世紀公司)、實時熒光定量PCR試劑盒(北京康為世紀公司)、普通PCR儀(Bio-Rad公司)、7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)等。

1.3方法

1.3.1引物設(shè)計 依據(jù)CK19的基因序列設(shè)計引物、探針，采用Prasgfm Express2.0軟件進行引物設(shè)計[4]。CK19的上游引物為：5’-ATG TGG TTA CCG TTC CGG GCC-3’，下游引物為：5’-AGC TAT CGG TCC GTC AAG TA-3’，Taqman探針為FAM-5’-AGG TAC CTA CTG CGT CAC GGT CAT TCC AT-3’。

1.3.2總RNA提取 抽取患者外周靜脈血5 mL，加入枸櫞酸鈉抗凝，將其分離為單細胞后收集于離心管中，離心，10 000 r/min，5 min；棄上清，向下層沉淀加入Trizol提取液1 mL，混勻，加200 μL氯仿，混勻，離心，10 000 r/min，15 min；棄沉淀、取上清于離心管中，加異丙醇500 μL，混勻，離心，10 000 r/min，10 min；75%乙醇漂洗，加DEPC水30μL用于溶解RNA，最后在紫外分光光度計下測定RNA的濃度及純度。

1.3.3逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)體系為：5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，2 μL的dNTP(10 mmol/L)，RNasin 1μL(40U)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL(200U)，OligodT15 1μL(1μg)，樣品總RNA 2μg，最后，加DEPC處理過的水至20 μL，混勻后置37℃環(huán)境中1 h，并于94℃條件下滅活M-MLV酶。

1.3.4RT-PCR擴增 PCR反應(yīng)體系:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液3 μL，CK19引物20 mol，Taq DNA酶1U，加DEPC處理過的水至30 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，57℃退火40 s，72℃ 90 s，進行35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物15 μL上樣于含0.5 μg/mL溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中，電泳，5 V/cm，40 min，最后，于紫外燈下觀察并拍攝記錄CK19 mRNA表達情況，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1.3.5酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測CK19蛋白的表達水平 采集結(jié)腸癌術(shù)后感染患者外周靜脈血3 mL，離心，3 000 r/min，15 min，取上清，采用ELISA檢測CK19蛋白表達水平，并分析外周血CK19蛋白表達量與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1.4觀察指標 統(tǒng)計兩組CK19 mRNA的陽性表達率；外周血CK19 mRNA陽性表達情況與患者臨床病理特征的關(guān)系；外周血CK19蛋白表達量與患者臨床病理特征的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1CK19 mRNA陽性表達率 觀察組中CK19 mRNA的陽性表達率為83.75%，對照組中CK19 mRNA的陽性表達率為27.50%，兩組比較有顯著性差異(P<0.01)。見表1。

表1 兩組患者CK19 mRNA陽性表達率比較[n(%)]

2.2外周血CK19 mRNA表達情況與患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)腸癌術(shù)后感染患者外周血CK19 mRNA陽性表達情況與患者的性別和年齡均無明顯相關(guān)性(P>0.05)；處于C或D分期、低分化和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的外周血CK19 mRNA陽性表達分別顯著高于A或B分期、中高分化和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 外周血CK19 mRNA表達情況與患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3外周血CK19蛋白表達量與患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)腸癌術(shù)后感染患者外周血CK19蛋白表達情況與患者性別和年齡均無明顯相關(guān)性(P>0.05)；處于C或D分期、低分化和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者外周血CK19蛋白表達水平分別顯著高于A或B分期、中高分化和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 外周血CK19蛋白表達量與患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢，成為威脅人類生存健康的常見消化道惡性腫瘤。隨著醫(yī)療衛(wèi)生條件的改善，結(jié)腸癌的治愈率并未得到顯著提高，目前仍以手術(shù)治療為主，但大部分患者易發(fā)生術(shù)后感染，且對于已出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的患者，預(yù)后較差，并且常規(guī)的檢查手段難以及時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移情況[5]。因此，盡快明確結(jié)腸癌的早期篩選標志物以及尋找有效的治療方法顯得尤為重要。

CK19是上皮細胞重要的中間纖維，其表達方式的不同反映著上皮細胞分化的不同途徑。研究[6]發(fā)現(xiàn)，大部分癌細胞分化后仍會保留起源細胞的CKs類型，提示可通過測定CKs的類型進而確定癌細胞的起源，指導(dǎo)擬定針對性的治療方案。目前，CK19與腫瘤相關(guān)的臨床參數(shù)已成為研究熱點。資料[7]顯示，CK19表達具有特異性，在正常骨髓、血液、淋巴結(jié)中未發(fā)現(xiàn)CK19表達，而在結(jié)、直腸癌中CK19卻呈現(xiàn)高表達，因此，CK19也被認為具有診斷是否發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者CK19陽性表達67例，陽性率為83.75%，對照組CK19陽性表達22例，陽性率為27.50%，兩組比較有顯著性差異，提示CK19 mRNA的陽性表達情況可能與結(jié)腸癌發(fā)生有一定的相關(guān)性。

CK19在判斷腫瘤分期、分化程度及微轉(zhuǎn)移情況相關(guān)研究中具有至關(guān)重要的作用。研究[8]發(fā)現(xiàn)，CK19是檢測乳腺癌外周血腋窩淋巴結(jié)及骨髓等組織中是否存在隱匿轉(zhuǎn)移的可靠標志物。有研究[9]表明，通過檢測乳腺癌患者外周血中CK19 mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白表達情況可對乳腺癌的早期診斷及預(yù)后等進行判斷。研究[10]顯示，肝癌患者CK19陽性表達的細胞具有增殖能力強、惡性程度高、侵襲力強及預(yù)后差等特征。此外，有研究[11-13]報道，在胃癌、肺癌、食管癌等惡性腫瘤的檢測中，CK19可作為腫瘤檢測的特異標志物。同時，也有研究[14]發(fā)現(xiàn)，根據(jù)結(jié)腸癌患者外周血CK19 mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白表達水平有助于監(jiān)測結(jié)腸癌微轉(zhuǎn)移情況。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌術(shù)后感染患者外周血CK19 mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白表達水平與患者的性別和年齡均無明顯相關(guān)性，而與患者Dukes分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，且與處于A或B分期、中高分化和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者相比，處于C或D分期、低分化和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的外周血CK19 mRNA陽性表達和蛋白表達水平均顯著升高，提示檢測外周血中CK19 mRNA轉(zhuǎn)錄與蛋白表達水平，可推斷患者外周血中是否有腫瘤細胞，判斷是否存在腫瘤微轉(zhuǎn)移，進而可指導(dǎo)結(jié)腸癌的早期干預(yù)，制定個體化的治療措施，尤其對已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者，可以指導(dǎo)其臨床診斷和治療。

綜上，結(jié)腸癌術(shù)后感染患者CK19 mRNA陽性表達率較高，且CK19 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平與腫瘤的分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況具有明顯相關(guān)性，這在結(jié)腸癌病變的早期診斷中具有指導(dǎo)性意義。