夏清青 祁佳 張宇鋒 江衛(wèi)龍△

(1.江陰市中醫(yī)院；南京中醫(yī)藥大學江陰附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 江陰 214400;2.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院藥劑科，上海 200092)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma,CVA)是以持續(xù)氣道慢性炎癥以及氣道高反應性為主要病理生理特點，臨床表現(xiàn)為以慢性咳嗽，可伴或不伴有喘息為主要特點，慢性咳嗽時常是其唯一的癥狀，其發(fā)病機理與哮喘相同[1]。CVA在祖國醫(yī)學多被稱為“風咳”、“哮咳”、“頑咳”、“咳喘”、“頓嗆”等病癥，近年來中醫(yī)藥在治療CVA顯現(xiàn)出比較積極的作用[2- 3]。黃芪作為傳統(tǒng)中藥，有補中益氣、益衛(wèi)固表、利水消腫等作用，目前已有臨床研究[4-5]表明黃芪治療CVA臨床療效顯著。目前針對黃芪治療CVA的研究多以研究單一化合物為主，局限于針對某個靶基因來探討其作用機制，然而黃芪成分多樣、復雜，單一研究缺乏全面性、整體性。網(wǎng)絡藥理學主張綜合網(wǎng)絡分析，與中藥多成分、多靶點、多通路的特點相符合，符合中醫(yī)的整體觀及辨證觀，目前已廣泛用于中藥的研究[6-7]。本研究運用中藥網(wǎng)絡藥理學的技術(shù)與方法，首次對黃芪治療CVA的藥理作用機制進行確定，通過構(gòu)建 “中藥-化合物-靶基因-疾病”的多層次網(wǎng)絡，進行綜合網(wǎng)絡分析，最終從整體角度探討黃芪治療CVA的作用機制，并結(jié)合其作用機制進一步通過臨床研究進行臨床療效驗證。

1 材料與方法

1.1“中藥-化合物-靶基因-疾病”網(wǎng)絡的構(gòu)建 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取黃芪的主要化合物，通過設定生物利用度(oral bioavailability,OB)、類藥性(drug-likeness,DL)等條件，篩選出候選化合物及其相應的靶基因[8]。在UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)檢索靶基因?qū)幕蚓幋a，并校正為官方名稱。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards. org/)以“cough variant asthma”為檢索詞，搜索出與CVA相關(guān)的疾病靶基因。將黃芪候選化合物的靶基因與CVA相關(guān)的疾病靶基因取交集，得到黃芪治療CVA的目標靶基因。使用Cytoscape3.6.0軟件構(gòu)建“中藥-化合物-靶基因-疾病”網(wǎng)絡，并對網(wǎng)絡進行分析，節(jié)點(node)代表黃芪、化合物、靶基因以及疾病，邊(edge)表示了它們之間的聯(lián)系，根據(jù)節(jié)點連接度值篩選出黃芪治療CVA的關(guān)鍵化合物。

1.2蛋白互作網(wǎng)絡的構(gòu)建和關(guān)鍵靶基因的篩選 把得到的黃芪治療CVA的目標靶基因所對應的基因編碼導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，限定研究物種為“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(protein-protein interaction network，PPI network)，得到黃芪作用于CVA的PPI網(wǎng)絡。應用Cytoscape3.6.0軟件分析篩選出黃芪治療CVA的關(guān)鍵靶基因。

1.3研究對象及治療方法 收集我院2017年1月至2018年12月肺病科門診治療的CVA患者80例，納入標準：(1)符合《咳嗽的診斷與治療指南》中CVA的診斷標準[9]；(2)支氣管舒張試驗陽性者；(3)入組前均未采取中藥治療；(4)對本次研究知情并同意者。排除標準：(1)合并其他嚴重支氣管或肺部疾病者；(2)合并嚴重肝腎功能不全者；(3)妊娠期或哺乳期女性；(4)對本研究中使用藥物過敏者。將患者隨機分為對照組和治療組各40例。對照組給予布地奈德福莫特羅粉吸入劑(AstraZeneca AB，批準文號H20140458)吸入治療，1吸/次(4.5 μg福莫特羅和160 μg布地奈德)，2次/d。治療組在對照組的基礎上加用中藥黃芪(顆粒劑，江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司)口服治療，開水沖服，每次10 g/1袋，2次/d。兩組均連續(xù)使用28 d后觀察臨床療效。另取我院治未病中心的40名健康體檢者作為正常組。

1.4療效判定及誘導痰檢測 制定咳嗽癥狀評分表，治療后咳嗽癥狀評分≤1分定義為痊愈；治療后咳嗽癥狀評分較治療前減少≥3分定義為顯效；治療后咳嗽癥狀評分較治療前減少<3分定義為有效；治療后咳嗽癥狀評分較治療前無減少或反而增加定義為無效。對所有患者治療前后進行評分。愈顯率=[(痊愈人數(shù)+顯效人數(shù))/總?cè)藬?shù)]×100%。參照既往方法[4,10]制備誘導痰。按測試盒說明書嚴格操作，采用ELISA法測定誘導痰IL-6水平。

2 結(jié) 果

2.1“中藥-化合物-靶基因-疾病”網(wǎng)絡的構(gòu)建和分析 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索黃芪的主要化合物，獲得黃芪的化合物共87個，設定OB≥30%、DL≥0.18，篩選出黃芪的候選化合物共20個，候選化合物的基本信息見表1。在TCMSP中獲得20個候選化合物的對應靶基因，并在UniProt數(shù)據(jù)庫，物種限定為Homo sapiens，轉(zhuǎn)換為對應的基因編碼，最終獲得97個靶基因及對應基因編碼，其中其中編號為：MOL000374、MOL000398、MOL000438、MOL000439的化合物未搜索到靶基因。從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到CVA相關(guān)疾病靶基因2231個。將97個黃芪化合物靶基因與2231個CVA相關(guān)疾病靶基因取交集，得到62個交集基因，即為黃芪治療CVA的目標靶基因，對應15個有效化合物，借助Cytocsape3.6.0軟件構(gòu)建“中藥-化合物-靶基因-疾病”網(wǎng)絡，網(wǎng)絡中有79個節(jié)點(化合物節(jié)點15個，靶基因節(jié)點62個，中藥黃芪節(jié)點1個，疾病節(jié)點1個)和219條邊，見圖1。圖中度值最高的化合物為槲皮素(度值：52)、山奈酚(度值：23)、7-O-甲基異丙醇胺(度值：13)、芒柄花黃素(度值：10)、3,9-二-O-甲基尼森香碗豆紫檀酚(度值：10)。這些度值較高的化合物可被認為是黃芪治療CVA的關(guān)鍵化合物。

表1 候選化合物的基本信息

圖1 中藥-化合物-靶基因-疾病網(wǎng)絡

2.2PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建和關(guān)鍵靶基因的篩選 為了進一步研究黃芪治療CVA的作用機制，將62個黃芪治療CVA的目標靶基因通過STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI網(wǎng)絡分析，獲取PPI網(wǎng)絡，選取互作分數(shù)(interaction score)≥0.4，網(wǎng)絡中有61個靶基因可以發(fā)生蛋白相互作用(有1個靶點未發(fā)生蛋白相互作用)，500條邊代表了它們之間相互作用，見圖2。圖中度值最高的靶基因為IL-6白細胞介素6(度值：40)、CASP3胱天蛋白酶3(度值：38)、EGFR表皮生長因子受體(度值：38)、VEGFA血管內(nèi)皮生長因子A(度值：38)、MAPK8絲裂原活化蛋白激酶8(度值：36)等(圖3)，推測這些靶基因可能是黃芪治療CVA的關(guān)鍵靶點。

圖2 黃芪治療CVA靶基因的PPI網(wǎng)絡

圖3 PPI網(wǎng)絡中黃芪治療CVA的關(guān)鍵靶點

2.3臨床療效 兩組按照咳嗽癥狀評分表進行評分，得出痊愈、顯效、有效、無效例數(shù)結(jié)果，分別為，治療組痊愈20例、顯效15例、有效4例、無效1例；對照組痊愈14例、顯效13例、有效10例、無效3例。治療組臨床治療愈顯率為87.5%，明顯高于對照組的67.5%(χ2=4.530,P=0.033)。

2.4黃芪對CVA患者誘導痰IL-6水平的影響 治療前，正常組誘導痰IL-6水平為(12.20±3.46)，治療組為(44.67±6.40)，對照組為(44.30±6.54)，均高于正常組(t=28.226、27.439，P均=0.000)；治療后，治療組誘導痰IL-6水平為(23.66±4.31)，對照組為(34.75±5.22)，兩組誘導痰IL-6水平均低于治療前(t=17.221、7.218，P均=0.000)；且治療后治療組誘導痰IL-6水平低于對照組(t=10.361，P=0.000)。

3 討 論

CVA與哮喘有著相同的發(fā)病機制，其臨床表現(xiàn)以慢性咳嗽為主[1,11]。中醫(yī)認為為風邪導致傷津化燥，累及肺絡，引起慢性咳嗽，臨床辨治多以辛溫去邪、補肺益氣等為主要原則[12]。黃芪有補中益氣、益衛(wèi)固表、利水消腫等作用，已有諸多研究[4,5,13]表明黃芪治療CVA臨床療效顯著。黃芪成分復雜，含有化合物較多，現(xiàn)有研究多局限于針對某個化合物來解釋黃芪的作用機制，缺乏宏觀整體。目前網(wǎng)絡藥理學被廣泛用于中藥的研究，網(wǎng)絡藥理學主張整體網(wǎng)絡、分組分析的研究方法，與中藥成分多樣、靶點豐富、通路繁多的特點相契合，通過網(wǎng)絡節(jié)點的連接和關(guān)系分析，實現(xiàn)分子作用的網(wǎng)絡整體分析，深度研究中藥與機體的相互作用[14,15]。

研究[16-17]顯示，黃芪治療CVA發(fā)揮作用的關(guān)鍵化合物有槲皮素、山奈酚、7-O-甲基異丙醇胺、芒柄花黃素、3,9-二-O-甲基尼森香碗豆紫檀酚等。已有研究[18]報道，槲皮素可抑制哮喘模型大鼠IL-5和IL-6的表達來治療哮喘；槲皮素對卵清蛋白誘導的支氣管哮喘模型小鼠具有明顯的保護作用。山奈酚可抑制過敏性哮喘小鼠氣道上皮細胞嗜酸性粒細胞浸潤和氣道炎癥。芒柄花黃素可能改善上皮細胞間E-cadheirn蛋白的表達以及分布，來抑制Th2型過敏性疾病[19]。本研究結(jié)果與已有的化合物研究相符合，說明黃芪治療CVA是由多種化合物多種成分共同發(fā)揮作用的。獲取PPI網(wǎng)絡分析顯示，黃芪治療CVA是由多靶點共同發(fā)揮作用的。IL-6、CASP3、EGFR、VEGFA、MAPK8，這些靶點可能是黃芪治療CVA的關(guān)鍵靶點。這些靶點與CVA的發(fā)病機理密切相關(guān)，已有研究[20]表明調(diào)節(jié)性T淋巴細胞亞群在CVA發(fā)病機制中起著主要作用，主要機制為體內(nèi)活性的致炎因子IL-6等被調(diào)節(jié)性T淋巴細胞分泌細胞因子抑制。

我們進一步通過臨床研究，驗證黃芪治療CVA的臨床療效，臨床研究顯示加用黃芪治療CVA與治療前以及對照組比較，患者誘導痰IL-6水平降低明顯，說明調(diào)節(jié)性T淋巴細胞亞群調(diào)節(jié)紊亂參與CVA的致病過程，與PPI網(wǎng)絡中IL-6靶點可能是黃芪治療CVA的關(guān)鍵靶點相符合，提示黃芪可以通過作用IL-6基因，調(diào)節(jié)CVA患者免疫狀態(tài)，進而發(fā)揮作用。臨床療效驗證方面顯示，加用黃芪治療CVA的愈顯率明顯優(yōu)于對照組，直接從臨床層面進行了驗證。

本研究尚存在一些不足，如通過數(shù)據(jù)庫搜集數(shù)據(jù)的全面與否及化合物篩選標準尚不能做到完全準確。此外，本研究臨床研究樣本較少，尚未考慮中藥劑量、劑型及用法對治療結(jié)果的影響。然而，本研究借助相應的數(shù)據(jù)庫和軟件，從中醫(yī)整體觀及辨證觀出發(fā)，與網(wǎng)絡藥理學分析方法相結(jié)合，構(gòu)建多層次網(wǎng)絡，對網(wǎng)絡節(jié)點的連接和關(guān)系進行分析，系統(tǒng)整體的對黃芪治療CVA的作用機制進行確定，并從臨床療效等方面進行驗證，為黃芪治療CVA作用機制提供新方向，更好的為今后的實驗及臨床研究提供依據(jù)及思路。