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        恩他卡朋片微生物限度檢查方法的建立及驗(yàn)證

        2022-08-08 03:21:10趙同申秦桂霞于洪華季智飛徐偉娜
        食品與藥品 2022年4期
        關(guān)鍵詞:稀釋劑山梨試液

        趙同申,秦桂霞,于洪華*,季智飛,徐偉娜

        (1. 山東華魯制藥有限公司,山東 聊城 252100;2. 山東省藥學(xué)科學(xué)院,山東 濟(jì)南 250101)

        恩他卡朋片是抗帕金森病藥物,有效成分為恩他卡朋,輔料包括甘露醇、微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、氫化蓖麻油。恩他卡朋片可作為左旋多巴/芐絲肼或左旋多巴/卡比多巴的輔助用藥,用于治療以上藥物不能控制的帕金森病及劑末現(xiàn)象(癥狀波動(dòng))。

        經(jīng)查閱文獻(xiàn),未見(jiàn)恩他卡朋片微生物限度檢驗(yàn)方法的研究。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)恩他卡朋片有抑菌作用,因此,本文建立了稀釋法消除抑菌性的微生物限度檢驗(yàn)方法,并選用3批樣品進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        SPX-250生化培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);DHP-600電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);MZ-301微生物限度儀(杭州美卓生物科技有限公司);濾膜(上海市新亞凈化器件廠,直徑50 mm,孔徑0.45 μm);YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);KF-3102電子天平(浙江凱豐集團(tuán)有限公司);DZKW-C恒溫水浴鍋(龍口市電爐制造廠)。

        1.2 試驗(yàn)菌種

        銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B)10 104〕,大腸埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B)44 102〕,金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 〔CMCC(B)26 003〕,枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)〔CMCC(B)63 501〕,白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F)98 001〕,黑曲霉(Aspergillus niger)〔CMCC(F)98 003〕,均購(gòu)自山東省食品藥品檢定研究院。

        1.3 培養(yǎng)基及試劑

        胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):210122),胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào):210129),沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):210223),麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):190301),麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào):200520),pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào):1901162,北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司)按標(biāo)簽說(shuō)明配制,經(jīng)高壓蒸汽滅菌后密封備用,培養(yǎng)基適用性自行完成,均符合規(guī)定。聚山梨酯80(批號(hào):20181016,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

        1.4 樣品

        恩他卡朋片(山東華魯制藥有限公司,批號(hào):200801,210301,210401)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 菌液制備

        取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物,分別用0.9 %無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度菌懸液。取含黑曲霉的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基,用含0.05 %聚山梨酯80的0.9 %無(wú)菌氯化鈉溶液將孢子洗脫,并稀釋制成適宜濃度黑曲霉孢子懸液。

        2.2 供試液制備

        稱取恩他卡朋片10 g,加含1 %聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml,置45 ℃恒溫水浴鍋中,振蕩至均勻分散,作為1:10(m:v)供試液。量取1:10供試液適量,用含1 %聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成1:20及1:50供試液。

        2.3 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

        分別取1:10,1:20及1:50供試液9.9 ml,置無(wú)菌試管中,分別加入試驗(yàn)菌菌懸液0.1 ml(含菌量不大于1000 cfu),混勻,取1 ml混勻后的供試液注入90 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中,加入培養(yǎng)基,其中接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的培養(yǎng)皿加胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,另取接種白色念珠菌、黑曲霉菌的培養(yǎng)皿加沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,凝固,將平皿倒置于相應(yīng)培養(yǎng)箱培養(yǎng),計(jì)數(shù)。

        同步取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液,作為菌液對(duì)照組;以含1 %聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液,作為稀釋劑對(duì)照;以供試液代替菌懸液,作為供試品對(duì)照。

        計(jì)算稀釋劑對(duì)照組回收比值,回收比值=稀釋劑對(duì)照組菌落數(shù)/菌液對(duì)照組菌落數(shù),回收比值應(yīng)在0.5~2.0范圍內(nèi)。結(jié)果見(jiàn)表1。

        小試最佳結(jié)果:當(dāng)塔頂溫度78℃,塔釜溫度100℃,回流比4∶1,塔頂餾出液氨氮濃度65 000 mg/L,折合氨水濃度7.9%,塔釜液氨氮濃度<10 mg/L。小試中塔釜脫氨液濃度達(dá)到預(yù)期,但塔頂氨水作為資源化尚不夠。分析原因:冷凝溫度不夠低,部分氨氣無(wú)法冷凝,從經(jīng)濟(jì)性角度考慮,宜采用吸收來(lái)替代冷凝??紤]到除防垢,對(duì)塔釜液進(jìn)行離心分離,塔釜液SS為1 046 mg/L,300r/min離心分離后,SS去除率約50%,800 r/min離心分離,SS去除率>75%,為中試提供依據(jù)。

        表1 稀釋劑對(duì)照組回收比值

        結(jié)果:含1 %聚山梨酯80稀釋劑對(duì)微生物無(wú)毒性。

        計(jì)算試驗(yàn)組回收比值,回收比值=(試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù))/菌液對(duì)照組菌落數(shù),回收比值應(yīng)在0.5~2.0范圍內(nèi)。結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 試驗(yàn)組回收比值

        結(jié)果:當(dāng)供試液濃度為1:50時(shí),試驗(yàn)組回收比值在0.5~2.0范圍內(nèi),可確認(rèn)供試液在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或抑菌作用可忽略不計(jì)。

        2.4 控制菌檢驗(yàn)方法適用性

        取1:10供試液10 ml,加含試驗(yàn)菌大腸埃希菌的菌懸液0.1 ml(含菌量不大于100 cfu),混勻,置于100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,混勻,33.0 ℃培養(yǎng)18 h,取培養(yǎng)物1 ml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中,43.0 ℃培養(yǎng)24 h,取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上,33.0 ℃培養(yǎng)18 h。

        同步設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照,陰性對(duì)照,供試品對(duì)照及稀釋劑對(duì)照。

        結(jié)果:陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng),試驗(yàn)有效。稀釋劑對(duì)照組、試驗(yàn)組均檢出試驗(yàn)菌,且菌落形態(tài)與陽(yáng)性對(duì)照組一致,確定為大腸埃希菌形態(tài)特征??梢耘卸?,含1 %聚山梨酯80稀釋劑對(duì)大腸埃希菌無(wú)毒性,1:10供試液在該檢驗(yàn)條件下可正常檢出大腸埃希菌。

        3 討論

        3.1 稀釋方式的選擇

        3.2 稀釋倍數(shù)的確定

        經(jīng)前期試驗(yàn),本品1:10供試液對(duì)微生物有抑制作用,且不溶于水,不宜采用薄膜過(guò)濾法,結(jié)合樣品特性及限度要求,遵循“就簡(jiǎn)不就繁”的原則,選用稀釋法,使每個(gè)平皿中樣品量降低,可有效去除藥品本身的抑菌性,且該方法操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性好[3-6]。綜上,選擇增加稀釋法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn),并設(shè)定不同稀釋濃度(1:10,1:20,1:50)進(jìn)行試驗(yàn),比較試驗(yàn)結(jié)果,最終確定供試液濃度在1:50時(shí)最佳。

        4 結(jié)論

        本品不屬于抗生素類藥品,從藥理作用及理化性質(zhì)方面,判斷不出是否具有抗菌性,在日常檢測(cè)中,容易忽略其可能存在的未知的抑菌性[7]。本研究采用增加供試液稀釋級(jí)別提高試驗(yàn)菌種的回收率[8],使微生物限度檢驗(yàn)更準(zhǔn)確,更科學(xué)有效,符合藥典要求。本文對(duì)類似性質(zhì)藥品的微生物限度檢驗(yàn)方法的建立及驗(yàn)證有一定參考意義。

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