鐘國男，張余芳，林 冠，鐘小麗

（?？谑袐D幼保健院 藥劑科，海南 海口 570203）

加味香連丸為清熱劑，是由木香、黃連（姜炙）、黃芩、黃柏（酒炙）、白芍、當歸、厚樸（姜炙）、枳殼（去瓤麩炒）、檳榔、延胡索（醋炙）、吳茱萸（甘草炙）、甘草（蜜炙） 十二味中藥組成[1]。方中黃連，清熱燥濕，止瀉痢，為君藥；黃芩、黃柏加強黃連清熱燥濕之功，共為臣藥；白芍、當歸和血止痛，延胡索理氣止痛，厚樸、枳殼、檳榔、木香行氣和中，行滯止痛，吳茱萸溫中燥濕止瀉，為佐藥；甘草健脾和中，調和藥性，為使藥；諸藥合用，共奏清熱祛濕，化滯止痛之功。臨床用于抗生素相關性腹瀉[2]、放射性腸炎[3]、潰瘍性結腸炎[4]。加味香連丸收載于2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》），現(xiàn)行標準僅對鹽酸小檗堿含量做限量要求，對木香、厚樸、枳殼和延胡索進行薄層定性鑒別。有關其質量控制的文獻主要集中于芍藥苷、柚皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、黃芩苷、木香烴內酯和去氫木香內酯等成分的測定[5-7]。

中藥制劑為多組分復雜體系，現(xiàn)行質量標準中薄層鑒別及含量測定均不能對加味香連丸進行整體描述和評價。中藥指紋圖譜是中藥或中藥制劑經適當處理后，借助一定的分析手段，得到的能標示其化學特征的色譜圖或光譜圖，能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學成分的種類與數量，進而對藥品質量進行整體描述和評價，具有“整體性”和“模糊性”的特點，已廣泛應用于中藥材和中藥制劑的質量控制[8-11]。目前加味香連丸指紋圖譜研究尚未報道。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法建立加味香連丸的指紋圖譜，并對其中的芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內酯、去氫木香內酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素11個主要活性成分的含量進行分析，為全面控制加味香連丸的質量提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BSA124S萬分之一分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；XS205十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250DBG型數控超聲波清洗器（功率：250 W，頻率：40 kHz，昆山超聲波儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

芍藥苷對照品（批號：110736-201842，含量以97.4 %計），柚皮苷對照品（批號：110722-201815，含量以91.7 %計），新橙皮苷對照品（批號：111857-201804，含量以99.4 %計），阿魏酸對照品（批號：110773-201614，含量以99.0 %計），木香烴內酯對照品（批號：111524-201911，含量以99.9 %計），去氫木香內酯對照品（批號：111525-201912，含量以99.5 %計），黃芩苷對照品（批號：110715-201720，含量以93.5 %計），鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-202015，含量以85.9 %計），和厚樸酚對照品（批號：110730-201915，含量以99.8 %計），厚樸酚對照品（批號：110729-202015，含量以99.0 %計），延胡索乙素對照品（批號：110726-201819，含量以99.8 %計），均購自中國食品藥品檢定研究院。加味香連丸[北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號分別為2080882（S1），20810197（S2），3080036（S3），3081265（S4），3082242（S5），3086576（S6），3086783（S7），4082251（S8），4083197（S9），4084062（S10），6080152（S11），6082278（S12），6087253（S13），60897421（S14），8080524（S15），規(guī)格為每100丸重6 g。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，實驗用水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05 %磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，15 %A；5～20 min，15 %A→35 %A；20～55 min，35 %A→60 %A；55～65 min，60 %A；65～75 min，60 %A→80 %A；75～80 min，80 %A→5 %A），流速為1.0 ml/min，檢測波長230 nm（8～12 min）、225 nm（29～32 min）、280 nm（0～8 min，12～29 min和32～80 min），柱溫30 ℃，進樣量10 μl，色譜記錄時間80 min。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內酯、去氫木香內酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素對照品，置量瓶中，分別加入甲醇溶液制備成質量濃度分別為1.374，7.915，2.339，1.537，0.888，0.847，11.947，17.584，1.085，3.019，0.355 mg/ml的單一對照品儲備液。分別精密量取上述單一對照品儲備液適量，置同一10 ml量瓶中，加入70 %甲醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，經0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得濃度分別為137.4，791.5，233.9，153.7，88.8，84.7，1194.7，1758.4，108.5，301.9，35.5 μg/ml的混合對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取加味香連丸供試品適量，研細，取約1.0 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入70 %甲醇30 ml，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再次稱定重量，用70 %甲醇補足減失的重量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即為供試品溶液，備用[12]。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取加味香連丸供試品（批號：2080882），按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖及峰面積，以13號色譜峰黃芩苷的保留時間為參照，計算得各共有峰的相對保留時間RSD均小于1.3 %（n=6），相對峰面積RSD均小于1.9 %（n=6），說明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取同一批加味香連丸供試品（批號：2080882）6份，每份約1 g，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖及峰面積，以13號色譜峰黃芩苷的保留時間為參照，計算得各共有峰的相對保留時間RSD均小于1.1 %（n=6），相對峰面積RSD均小于1.5 %（n=6），說明本方法重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取加味香連丸供試品（批號：2080882），按2.3項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，12，16，24 h，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖及峰面積，以13號色譜峰黃芩苷的保留時間為參照，計算得各共有峰的相對保留時間RSD均小于1.5 %（n=6），相對峰面積RSD均小于1.6 %（n=6），表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩(wěn)定。

2.4.4 指紋圖譜的建立及相似度評價 取15批加味香連丸供試品，按2.3項下方法分別制備成供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄HPLC色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版）（以下簡稱《相似度評價系統(tǒng)》）軟件評價分析，以編號S1號樣品的色譜圖為參考圖譜，設置時間窗寬度0.2 min，采用多點校正全譜匹配法建立指紋圖譜共有模式，并以平均值法生成對照圖譜。結果共標定29個共有峰，15批加味香連丸指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.997，0.993，0.992，0.998，0.996，0.991，0.999，0.995，0.995，0.996，0.994，0.995，0.999，0.997，0.992，相似度均大于0.99，說明15批加味香連丸化學成分一致性較好。指紋圖譜及其共有模式見圖1。

圖1 15批加味香連丸HPLC指紋圖譜

指紋圖譜共獲得29個保留時間較穩(wěn)定的共有峰，通過比對混合對照品溶液色譜圖共指認出11個化合物，分別是3號色譜峰芍藥苷、4號色譜峰柚皮苷、5號色譜峰新橙皮苷、8號色譜峰阿魏酸、11號色譜峰木香烴內酯、12號色譜峰去氫木香內酯、13號色譜峰黃芩苷、21號色譜峰鹽酸小檗堿、26號色譜峰和厚樸酚、27號色譜峰厚樸酚、28號色譜峰延胡索乙素，其中13號色譜峰保留時間相對居中，與相鄰色譜峰分離度好，峰高和峰面積較適中，因此選擇13號峰（黃芩苷）作為參照峰，計算其他共有峰的相對峰面積和相對保留時間[13-14]。結果29個共有峰的相對保留時間RSD均小于1.90 %（n=15），相對峰面積RSD為0.90 %～21.27 %，具體數據見表1。對照品溶液色譜圖見圖2。

表1 15批加味香連丸共有峰相對峰面積

圖2 混合對照品溶液HPLC圖譜

2.5 加味香連丸中11個成分含量測定

2.5.1 色譜條件 同2.1項下色譜條件。

2.5.2 混合對照品溶液的制備 按2.2項下方法制備。

2.5.3 供試品溶液的制備 按2.3項下方法制備。

2.5.4 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.2，1，2，4，8，10 ml，置10 ml量瓶，用70 %甲醇溶液定容至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以峰面積（y）為縱坐標，以樣品濃度（x，μg/ml）為橫坐標進行線性回歸，回歸方程見表2。

表2 回歸方程和線性范圍

2.5.5 精密度試驗 取加味香連丸供試品（批號：2080882），按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖及11個化合物峰面積。結果芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內酯、去氫木香內酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素峰面積RSD分別為0.96 %，1.12 %，0.88 %，1.36 %，1.41 %，1.22 %，1.57 %，0.69 %，1.01 %，1.24 %，1.18 %（n=6），說明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 取加味香連丸供試品（批號：2080882），按2.3項下方法制備供試品溶液，室溫條件放置0，4，8，16，20，24 h，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖及11個化合物峰面積。結果芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內酯、去氫木香內酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素峰面積RSD分別為1.15 %，0.77 %，0.92 %，1.03 %，1.41 %，1.11 %，0.89 %，1.36 %，1.44 %，1.25 %，1.39 %（n=6），表明室溫條件下供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.5.7 重復性試驗 取同一批加味香連丸供試品（批號：2080882）6份，每份約1.0 g，精密稱定，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖及11個化合物峰面積。結果芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內酯、去氫木香內酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素平均含量分別為1.041，5.996，1.772，1.163，0.673，0.642，9.051，13.321，0.822，2.287，0.269 mg/g，RSD分別為1.16 %，0.55 %，0.34 %，0.61 %，0.77 %，0.59 %，1.15 %，0.39 %，0.62 %，0.74 %，0.26 %（n=6），表明該方法重復性良好。

2.5.8 加樣回收試驗 取已知含量的加味香連丸供試品9份，研細，每份取約0.5 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，分成3組，分別精密加入含芍藥苷（0.208 mg/ml）、柚皮苷（1.201 mg/ml）、新橙皮苷（0.355 mg/ml）、阿魏酸（0.233 mg/ml）、木香烴內酯（0.135 mg/ml）、去氫木香內酯（0.129 mg/ml）、黃芩苷（1.813 mg/ml）、鹽酸小檗堿（2.668 mg/ml）、和厚樸酚（0.165 mg/ml）、厚樸酚（0.458 mg/ml）、延胡索乙素（0.054 mg/ml）混合對照品溶液3，2.5，2 ml，按2.3項下方法制備，按2.1項下色譜條件分析，記錄色譜圖及峰面積，計算11個化合物的平均加樣回收率及RSD值。結果芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內酯、去氫木香內酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素平均加樣回收率分別為102.3 %，96.2 %，101.6 %，102.7 %，100.8 %，98.4 %，101.9 %，102.5 %，98.2 %，103.7 %，102.9 %，RSD分別為0.55 %，2.29 %，1.07 %，0.84 %，1.01 %，1.28 %，1.61 %，0.72 %，0.91 %，0.72 %，1.49 %（n=9）。具體數據見表3。

表3 加樣回收結果（n=9）

2.5.9 樣品含量測定 取15批加味香連丸供試品，精密稱定，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分析，記錄色譜圖及峰面積，并計算11個化合物的含量，結果見表4。

表4 樣品測定結果（n=3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

本文采用DAD檢測器，在190～400 nm全波長掃描加味香連丸供試品溶液，發(fā)現(xiàn)在波長280 nm處色譜峰數量較多，但芍藥苷在230 nm波長處、木香烴內酯和去氫木香內酯在225 nm波長處有最大吸收，為使各成分及指紋圖譜均在其最大吸收波長處進行測定，采用不同時段切換不同檢測波長的方法，即0～8 min，12～29 min和32～80 min檢測波長為280 nm，檢測26個共有峰及柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素，8～12 min檢測波長為230 nm，檢測芍藥苷，29～32 min檢測波長為225 nm，檢測木香烴內酯和去氫木香內酯。

3.2 洗脫條件的選擇

本研究首先考察了不同比例乙腈-水、甲醇-水及乙腈-甲醇-水流動相系統(tǒng)對加味香連丸各成分的分離效果，發(fā)現(xiàn)甲醇作為有機相時，供試品溶液色譜圖中色譜峰較少，基線不平穩(wěn)，柱壓較高，而乙腈作為有機相不僅洗脫能力強、基線平穩(wěn)、柱壓低，且色譜峰峰形較好；水作為水相時，目標成分木香烴內酯和去氫木香內酯分離度不佳，水相更換為0.05 %磷酸水溶液后，兩者可達到分離度要求，其他各色譜峰分離度也較好，基線平穩(wěn)，峰形較好，指紋圖譜色譜峰數量多，故選用乙腈-0.05 %磷酸作為流動相梯度洗脫系統(tǒng)。

3.3 供試品制備方法優(yōu)化

本研究以加味香連丸指紋圖譜中色譜峰數量、相鄰色譜峰分離效果及11個待測化合物提取率為指標，依次對提取方式（超聲提取、加熱回流提取、冷浸提取）、提取溶劑（水、稀乙醇、70 %乙醇、95 %乙醇、甲醇、70 %甲醇、50 %甲醇）進行考察，結果顯示70 %甲醇溶液超聲提取色譜峰較多，相鄰色譜峰分離效果較好，11個化合物的提取率較高；同時對70 %甲醇溶液超聲提取時間（15，30，40，60 min）考察，結果顯示提取時間為30 min時27個共有峰峰面積及11個化合物提取率最大，故最終確定70 %甲醇超聲提取30 min作為加味香連丸供試品溶液的制備方法。

3.4 測定結果分析

15批加味香連丸相似性評價結果顯示，樣品與對照指紋圖譜間相似度均大于0.99，說明加味香連丸批間差異較小，質量較穩(wěn)定，共生成29個共有峰，通過與對照品比對指認了其中11個共有峰。11個化合物含量測定結果顯示，芍藥苷含量為0.652～1.618 mg/g、柚皮苷含量為3.843～6.058 mg/g、新橙皮苷含量為0.658～1.775 mg/g、阿魏酸含量為0.766～1.259 mg/g、木香烴內酯含量為0.368～0.781 mg/g、去氫木香內酯含量為0.433～0.761 mg/g、黃芩苷含量為6.310～9.807 mg/g、鹽酸小檗堿含量為10.512～13.461 mg/g、和厚樸酚含量為0.614～0.941 mg/g、厚樸酚含量為1.365～2.521 mg/g、延胡索乙素含量為0.169～0.469 mg/g。根據《中國藥典》標準規(guī)定加味香連丸“每1 g含黃連、黃柏以鹽酸小檗堿計，不得少7.0 mg”，本研究鹽酸小檗堿測定結果符合上述規(guī)定。

本研究建立了加味香連丸HPLC指紋圖譜，并同時指認和測定了芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內酯、去氫木香內酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素11個化合物的含量，方法穩(wěn)定簡單，能系統(tǒng)快速地評價該制劑的質量，對全面控制加味香連丸的質量具有指導意義。