鐘國男,張余芳,林 冠,鐘小麗
(??谑袐D幼保健院 藥劑科,海南 海口 570203)
加味香連丸為清熱劑,是由木香、黃連(姜炙)、黃芩、黃柏(酒炙)、白芍、當(dāng)歸、厚樸(姜炙)、枳殼(去瓤麩炒)、檳榔、延胡索(醋炙)、吳茱萸(甘草炙)、甘草(蜜炙) 十二味中藥組成[1]。方中黃連,清熱燥濕,止瀉痢,為君藥;黃芩、黃柏加強(qiáng)黃連清熱燥濕之功,共為臣藥;白芍、當(dāng)歸和血止痛,延胡索理氣止痛,厚樸、枳殼、檳榔、木香行氣和中,行滯止痛,吳茱萸溫中燥濕止瀉,為佐藥;甘草健脾和中,調(diào)和藥性,為使藥;諸藥合用,共奏清熱祛濕,化滯止痛之功。臨床用于抗生素相關(guān)性腹瀉[2]、放射性腸炎[3]、潰瘍性結(jié)腸炎[4]。加味香連丸收載于2020年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》),現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對鹽酸小檗堿含量做限量要求,對木香、厚樸、枳殼和延胡索進(jìn)行薄層定性鑒別。有關(guān)其質(zhì)量控制的文獻(xiàn)主要集中于芍藥苷、柚皮苷、和厚樸酚、厚樸酚、黃芩苷、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯等成分的測定[5-7]。
中藥制劑為多組分復(fù)雜體系,現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中薄層鑒別及含量測定均不能對加味香連丸進(jìn)行整體描述和評價(jià)。中藥指紋圖譜是中藥或中藥制劑經(jīng)適當(dāng)處理后,借助一定的分析手段,得到的能標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖,能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量,進(jìn)而對藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價(jià),具有“整體性”和“模糊性”的特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于中藥材和中藥制劑的質(zhì)量控制[8-11]。目前加味香連丸指紋圖譜研究尚未報(bào)道。本研究采用高效液相色譜(HPLC)法建立加味香連丸的指紋圖譜,并對其中的芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素11個(gè)主要活性成分的含量進(jìn)行分析,為全面控制加味香連丸的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司);BSA124S萬分之一分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);XS205十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KQ-250DBG型數(shù)控超聲波清洗器(功率:250 W,頻率:40 kHz,昆山超聲波儀器有限公司)。
芍藥苷對照品(批號:110736-201842,含量以97.4 %計(jì)),柚皮苷對照品(批號:110722-201815,含量以91.7 %計(jì)),新橙皮苷對照品(批號:111857-201804,含量以99.4 %計(jì)),阿魏酸對照品(批號:110773-201614,含量以99.0 %計(jì)),木香烴內(nèi)酯對照品(批號:111524-201911,含量以99.9 %計(jì)),去氫木香內(nèi)酯對照品(批號:111525-201912,含量以99.5 %計(jì)),黃芩苷對照品(批號:110715-201720,含量以93.5 %計(jì)),鹽酸小檗堿對照品(批號:110713-202015,含量以85.9 %計(jì)),和厚樸酚對照品(批號:110730-201915,含量以99.8 %計(jì)),厚樸酚對照品(批號:110729-202015,含量以99.0 %計(jì)),延胡索乙素對照品(批號:110726-201819,含量以99.8 %計(jì)),均購自中國食品藥品檢定研究院。加味香連丸[北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠,批號分別為2080882(S1),20810197(S2),3080036(S3),3081265(S4),3082242(S5),3086576(S6),3086783(S7),4082251(S8),4083197(S9),4084062(S10),6080152(S11),6082278(S12),6087253(S13),60897421(S14),8080524(S15),規(guī)格為每100丸重6 g。甲醇、乙腈為色譜純,磷酸為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。
色譜柱:Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.05 %磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0~5 min,15 %A;5~20 min,15 %A→35 %A;20~55 min,35 %A→60 %A;55~65 min,60 %A;65~75 min,60 %A→80 %A;75~80 min,80 %A→5 %A),流速為1.0 ml/min,檢測波長230 nm(8~12 min)、225 nm(29~32 min)、280 nm(0~8 min,12~29 min和32~80 min),柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μl,色譜記錄時(shí)間80 min。
分別精密稱取芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素對照品,置量瓶中,分別加入甲醇溶液制備成質(zhì)量濃度分別為1.374,7.915,2.339,1.537,0.888,0.847,11.947,17.584,1.085,3.019,0.355 mg/ml的單一對照品儲備液。分別精密量取上述單一對照品儲備液適量,置同一10 ml量瓶中,加入70 %甲醇溶液稀釋并定容至刻度,搖勻,經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過,即得濃度分別為137.4,791.5,233.9,153.7,88.8,84.7,1194.7,1758.4,108.5,301.9,35.5 μg/ml的混合對照品溶液,備用。
取加味香連丸供試品適量,研細(xì),取約1.0 g,精密稱定,置100 ml具塞錐形瓶中,精密加入70 %甲醇30 ml,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再次稱定重量,用70 %甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液即為供試品溶液,備用[12]。
2.4.1 精密度試驗(yàn) 取加味香連丸供試品(批號:2080882),按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針,記錄色譜圖及峰面積,以13號色譜峰黃芩苷的保留時(shí)間為參照,計(jì)算得各共有峰的相對保留時(shí)間RSD均小于1.3 %(n=6),相對峰面積RSD均小于1.9 %(n=6),說明儀器精密度良好。
2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批加味香連丸供試品(批號:2080882)6份,每份約1 g,按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖及峰面積,以13號色譜峰黃芩苷的保留時(shí)間為參照,計(jì)算得各共有峰的相對保留時(shí)間RSD均小于1.1 %(n=6),相對峰面積RSD均小于1.5 %(n=6),說明本方法重復(fù)性良好。
2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取加味香連丸供試品(批號:2080882),按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于室溫下放置0,4,8,12,16,24 h,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖及峰面積,以13號色譜峰黃芩苷的保留時(shí)間為參照,計(jì)算得各共有峰的相對保留時(shí)間RSD均小于1.5 %(n=6),相對峰面積RSD均小于1.6 %(n=6),表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.4.4 指紋圖譜的建立及相似度評價(jià) 取15批加味香連丸供試品,按2.3項(xiàng)下方法分別制備成供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄HPLC色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(2012A版)(以下簡稱《相似度評價(jià)系統(tǒng)》)軟件評價(jià)分析,以編號S1號樣品的色譜圖為參考圖譜,設(shè)置時(shí)間窗寬度0.2 min,采用多點(diǎn)校正全譜匹配法建立指紋圖譜共有模式,并以平均值法生成對照圖譜。結(jié)果共標(biāo)定29個(gè)共有峰,15批加味香連丸指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.997,0.993,0.992,0.998,0.996,0.991,0.999,0.995,0.995,0.996,0.994,0.995,0.999,0.997,0.992,相似度均大于0.99,說明15批加味香連丸化學(xué)成分一致性較好。指紋圖譜及其共有模式見圖1。
圖1 15批加味香連丸HPLC指紋圖譜
指紋圖譜共獲得29個(gè)保留時(shí)間較穩(wěn)定的共有峰,通過比對混合對照品溶液色譜圖共指認(rèn)出11個(gè)化合物,分別是3號色譜峰芍藥苷、4號色譜峰柚皮苷、5號色譜峰新橙皮苷、8號色譜峰阿魏酸、11號色譜峰木香烴內(nèi)酯、12號色譜峰去氫木香內(nèi)酯、13號色譜峰黃芩苷、21號色譜峰鹽酸小檗堿、26號色譜峰和厚樸酚、27號色譜峰厚樸酚、28號色譜峰延胡索乙素,其中13號色譜峰保留時(shí)間相對居中,與相鄰色譜峰分離度好,峰高和峰面積較適中,因此選擇13號峰(黃芩苷)作為參照峰,計(jì)算其他共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間[13-14]。結(jié)果29個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間RSD均小于1.90 %(n=15),相對峰面積RSD為0.90 %~21.27 %,具體數(shù)據(jù)見表1。對照品溶液色譜圖見圖2。
表1 15批加味香連丸共有峰相對峰面積
圖2 混合對照品溶液HPLC圖譜
2.5.1 色譜條件 同2.1項(xiàng)下色譜條件。
2.5.2 混合對照品溶液的制備 按2.2項(xiàng)下方法制備。
2.5.3 供試品溶液的制備 按2.3項(xiàng)下方法制備。
2.5.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液0.2,1,2,4,8,10 ml,置10 ml量瓶,用70 %甲醇溶液定容至刻度,搖勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。以峰面積(y)為縱坐標(biāo),以樣品濃度(x,μg/ml)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,回歸方程見表2。
表2 回歸方程和線性范圍
2.5.5 精密度試驗(yàn) 取加味香連丸供試品(批號:2080882),按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針,記錄色譜圖及11個(gè)化合物峰面積。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素峰面積RSD分別為0.96 %,1.12 %,0.88 %,1.36 %,1.41 %,1.22 %,1.57 %,0.69 %,1.01 %,1.24 %,1.18 %(n=6),說明儀器精密度良好。
2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取加味香連丸供試品(批號:2080882),按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,室溫條件放置0,4,8,16,20,24 h,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖及11個(gè)化合物峰面積。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素峰面積RSD分別為1.15 %,0.77 %,0.92 %,1.03 %,1.41 %,1.11 %,0.89 %,1.36 %,1.44 %,1.25 %,1.39 %(n=6),表明室溫條件下供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批加味香連丸供試品(批號:2080882)6份,每份約1.0 g,精密稱定,按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖及11個(gè)化合物峰面積。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素平均含量分別為1.041,5.996,1.772,1.163,0.673,0.642,9.051,13.321,0.822,2.287,0.269 mg/g,RSD分別為1.16 %,0.55 %,0.34 %,0.61 %,0.77 %,0.59 %,1.15 %,0.39 %,0.62 %,0.74 %,0.26 %(n=6),表明該方法重復(fù)性良好。
2.5.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的加味香連丸供試品9份,研細(xì),每份取約0.5 g,精密稱定,置100 ml具塞錐形瓶中,分成3組,分別精密加入含芍藥苷(0.208 mg/ml)、柚皮苷(1.201 mg/ml)、新橙皮苷(0.355 mg/ml)、阿魏酸(0.233 mg/ml)、木香烴內(nèi)酯(0.135 mg/ml)、去氫木香內(nèi)酯(0.129 mg/ml)、黃芩苷(1.813 mg/ml)、鹽酸小檗堿(2.668 mg/ml)、和厚樸酚(0.165 mg/ml)、厚樸酚(0.458 mg/ml)、延胡索乙素(0.054 mg/ml)混合對照品溶液3,2.5,2 ml,按2.3項(xiàng)下方法制備,按2.1項(xiàng)下色譜條件分析,記錄色譜圖及峰面積,計(jì)算11個(gè)化合物的平均加樣回收率及RSD值。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素平均加樣回收率分別為102.3 %,96.2 %,101.6 %,102.7 %,100.8 %,98.4 %,101.9 %,102.5 %,98.2 %,103.7 %,102.9 %,RSD分別為0.55 %,2.29 %,1.07 %,0.84 %,1.01 %,1.28 %,1.61 %,0.72 %,0.91 %,0.72 %,1.49 %(n=9)。具體數(shù)據(jù)見表3。
表3 加樣回收結(jié)果(n=9)
2.5.9 樣品含量測定 取15批加味香連丸供試品,精密稱定,按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件分析,記錄色譜圖及峰面積,并計(jì)算11個(gè)化合物的含量,結(jié)果見表4。
表4 樣品測定結(jié)果(n=3)
本文采用DAD檢測器,在190~400 nm全波長掃描加味香連丸供試品溶液,發(fā)現(xiàn)在波長280 nm處色譜峰數(shù)量較多,但芍藥苷在230 nm波長處、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯在225 nm波長處有最大吸收,為使各成分及指紋圖譜均在其最大吸收波長處進(jìn)行測定,采用不同時(shí)段切換不同檢測波長的方法,即0~8 min,12~29 min和32~80 min檢測波長為280 nm,檢測26個(gè)共有峰及柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素,8~12 min檢測波長為230 nm,檢測芍藥苷,29~32 min檢測波長為225 nm,檢測木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯。
本研究首先考察了不同比例乙腈-水、甲醇-水及乙腈-甲醇-水流動相系統(tǒng)對加味香連丸各成分的分離效果,發(fā)現(xiàn)甲醇作為有機(jī)相時(shí),供試品溶液色譜圖中色譜峰較少,基線不平穩(wěn),柱壓較高,而乙腈作為有機(jī)相不僅洗脫能力強(qiáng)、基線平穩(wěn)、柱壓低,且色譜峰峰形較好;水作為水相時(shí),目標(biāo)成分木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯分離度不佳,水相更換為0.05 %磷酸水溶液后,兩者可達(dá)到分離度要求,其他各色譜峰分離度也較好,基線平穩(wěn),峰形較好,指紋圖譜色譜峰數(shù)量多,故選用乙腈-0.05 %磷酸作為流動相梯度洗脫系統(tǒng)。
本研究以加味香連丸指紋圖譜中色譜峰數(shù)量、相鄰色譜峰分離效果及11個(gè)待測化合物提取率為指標(biāo),依次對提取方式(超聲提取、加熱回流提取、冷浸提?。?、提取溶劑(水、稀乙醇、70 %乙醇、95 %乙醇、甲醇、70 %甲醇、50 %甲醇)進(jìn)行考察,結(jié)果顯示70 %甲醇溶液超聲提取色譜峰較多,相鄰色譜峰分離效果較好,11個(gè)化合物的提取率較高;同時(shí)對70 %甲醇溶液超聲提取時(shí)間(15,30,40,60 min)考察,結(jié)果顯示提取時(shí)間為30 min時(shí)27個(gè)共有峰峰面積及11個(gè)化合物提取率最大,故最終確定70 %甲醇超聲提取30 min作為加味香連丸供試品溶液的制備方法。
15批加味香連丸相似性評價(jià)結(jié)果顯示,樣品與對照指紋圖譜間相似度均大于0.99,說明加味香連丸批間差異較小,質(zhì)量較穩(wěn)定,共生成29個(gè)共有峰,通過與對照品比對指認(rèn)了其中11個(gè)共有峰。11個(gè)化合物含量測定結(jié)果顯示,芍藥苷含量為0.652~1.618 mg/g、柚皮苷含量為3.843~6.058 mg/g、新橙皮苷含量為0.658~1.775 mg/g、阿魏酸含量為0.766~1.259 mg/g、木香烴內(nèi)酯含量為0.368~0.781 mg/g、去氫木香內(nèi)酯含量為0.433~0.761 mg/g、黃芩苷含量為6.310~9.807 mg/g、鹽酸小檗堿含量為10.512~13.461 mg/g、和厚樸酚含量為0.614~0.941 mg/g、厚樸酚含量為1.365~2.521 mg/g、延胡索乙素含量為0.169~0.469 mg/g。根據(jù)《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定加味香連丸“每1 g含黃連、黃柏以鹽酸小檗堿計(jì),不得少7.0 mg”,本研究鹽酸小檗堿測定結(jié)果符合上述規(guī)定。
本研究建立了加味香連丸HPLC指紋圖譜,并同時(shí)指認(rèn)和測定了芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、黃芩苷、鹽酸小檗堿、和厚樸酚、厚樸酚、延胡索乙素11個(gè)化合物的含量,方法穩(wěn)定簡單,能系統(tǒng)快速地評價(jià)該制劑的質(zhì)量,對全面控制加味香連丸的質(zhì)量具有指導(dǎo)意義。