馬曉慧，劉江涵子，羅淦清，李怡芳，栗原博，何蓉蓉

(暨南大學 1.廣東省疾病易感性及中醫(yī)藥研發(fā)工程技術研究中心、2. 藥學院、3. 廣東省中藥藥效物質基礎及創(chuàng)新藥物研究重點實驗室， 廣東 廣州 510632；4. 新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830054；5. 暨南大學中醫(yī)學院，廣東 廣州 510632)

冠心病引發(fā)的心肌缺血是導致心血管不良事件的最主要因素之一，脂質代謝異常導致的血管腔狹窄是引發(fā)心肌缺血的主要誘因。甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，TC)及低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)等可作為冠心病的重要診斷依據(jù)。隨著醫(yī)學檢測技術的革新，冠心病的診斷與治療方面已經(jīng)取得了較大的進展，但每年患病率仍然居高不下，這可能與無法建立完善的臨床前預測篩查機制相關。目前，尋找有效的生物靶標并將其作為預測、防治冠心病發(fā)展的生物標記物迫在眉睫。冠心病是一個漫長的疾病發(fā)展過程，不同階段引發(fā)的心肌損傷機制各有不同。因此，研究心肌細胞在不同病理階段的損傷特征已成為研究者們不斷探索的方向。

心肌細胞損傷引發(fā)的心臟功能減退與死亡是臨床不良事件發(fā)生的主要病理機制。心肌細胞損傷多由“意外”引發(fā)，目前針對心肌細胞的死亡方式主要聚焦于細胞凋亡、壞死性凋亡、細胞焦亡和自噬。但是，這些死亡方式都不足以解釋其發(fā)病機制和病理進程。深入研究這些心肌死亡方式，可以發(fā)現(xiàn)它們存在一個共同特征——心肌細胞存在大量脂質過氧化積累。脂質過氧化有酶介導和非酶介導這兩種途徑，其中酶介導的磷脂過氧化與近些年來新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡方式——“鐵死亡”密切相關。有研究揭示了心臟損傷中確實存在鐵死亡現(xiàn)象，而這一重要發(fā)現(xiàn)為冠心病的防治提供了新策略[1-2]。基于心肌細胞損傷而引發(fā)心臟功能衰退的研究一直存在較大爭議，但探索步伐卻從未停止，尤其隨著鐵死亡在心肌細胞損傷中的作用機制被發(fā)現(xiàn)，磷脂過氧化在心肌細胞損傷過程中被賦予舉足輕重的意義。本文主要以磷脂過氧化損傷為著眼點，對心肌細胞損傷機制的近期研究進展進行綜述，并提出新的觀點與展望，旨在全面、深入研究磷脂過氧化損傷對心肌的調控機制，為冠心病的防治策略和診斷提供新的參考，以期延長患者壽命、提高患者生活質量。

1 磷脂過氧化與冠心病診斷

1.1 TC、TG及其氧化衍生物對冠心病診斷的局限性TC與TG是最早發(fā)現(xiàn)的冠心病診斷標志物，但將其作為冠心病的獨立診斷依據(jù)一直存在較大爭議。TG和TC的變化受多種疾病的影響，特別是肝臟相關疾病，這大大降低了臨床診斷的可靠性。有研究表明，當冠心病患者進行二級預防干預后，TG和TC的檢測水平與冠心病發(fā)病的相關性明顯減少[3]。由此可見，TG和TC水平的變化或許無法作為冠心病的直接預測標志物。隨后，研究者將目光投向了對TG和TC氧化衍生物的研究。Shrestha等[4]首次發(fā)現(xiàn)了在患者血液中存在11種氧化的TG，并與冠心病的發(fā)病密切相關，但具體作用機制尚不明確。此外，7α-羥化酶介導的TC氧化促進細胞膜滲透性，使胞內Ca2+濃度增加[5]，這提示TC的過氧化產(chǎn)物能夠增加冠心病的風險，參與其疾病進展。迄今為止，雖然TG與TC的氧化衍生產(chǎn)物對冠心病的影響已嶄露頭角，但仍無法確定其臨床診斷價值及具體作用機制。

1.2 磷脂及其氧化衍生物對冠心病診斷的優(yōu)勢早在1966年就有研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血液中的磷脂含量明顯增加。近年來，有研究者證實了磷脂含量的變化是冠心病患者的一個病理特征，并認為磷脂對診斷冠心病具有重要意義。當這個觀點一經(jīng)提出后，越來越多的研究者將目光投向對磷脂及其代謝產(chǎn)物在冠心病方面的研究。有臨床研究分析指出，磷脂不僅對冠心病不良事件具有較好的預測性，可用于二級預防的預測。此外，有研究在患者血液中發(fā)現(xiàn)了8種氧化脂質與冠心病的發(fā)病有較強的相關性，其中氧化磷脂尤為顯著，且在不同程度患者中相差高達4.7倍[6]。

在冠心病疾病過程中，磷脂不僅僅來源于機體的生物膜，還可源于具有轉運TG與TC功能的LDL。雖然氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)對冠心病的診斷具有一定的意義，但易于被清道夫受體識別進行代謝，且目前尚無血漿中存在ox-LDL的直接證據(jù)。大多數(shù)學者是通過ELISA的方法間接推測血漿中ox-LDL的含量，故ox-LDL這種檢測方法是否能夠應用于臨床冠心病診斷有待證實。在LDL氧化修飾的過程中主要與其表面的磷脂層密切相關，可導致氧化磷脂、TG與TC在體內的堆積，加速泡沫細胞的形成并推動動脈粥樣硬化形成(Fig 1)。綜上所述，在冠心病發(fā)展過程中，氧化磷脂是生物膜損傷以及LDL代謝過程中的共有產(chǎn)物，在血液中相對穩(wěn)定，或可將其作為一種新型臨床防治及診斷冠心病的關鍵標志物，但具體機制仍需更多的研究證據(jù)支持這一觀點的合理性。

Fig 1 Mechanism of ALOX15 on phospholipid peroxidation

2 ALOX15與冠心病發(fā)病機制

早期對花生四烯酸-15-脂加氧酶(arachidonic acid-15-lipoxygenase，ALOX15)的研究主要圍繞冠心病的經(jīng)典炎癥致病學說展開，這是因為ALOX15的代謝產(chǎn)物可間接參與炎癥反應，也可以通過調節(jié)細胞中促炎物質的表達直接加快冠心病疾病進程。目前，對ALOX15在炎癥方面的作用機制已有許多綜述進行總結，但是通過對炎癥機制的干預不足以明確闡釋冠心病的復雜病理機制，而且在臨床實驗中應用一些抗炎藥物的療效也不完全令人滿意[7]，令很多專家十分困惑。由此，研究者們逐漸將目光投向了對ALOX15其他作用機制方面的研究。

2.1 ALOX15的結構與分型脂氧合酶(lipoxygenase，LOXs)是一種不含血紅素鐵的酶，其主要功能是催化氧直接進入多不飽和脂肪。根據(jù)LOXs在哺乳動物中催化各種二十碳烯酸的不同位點將其分為5-LOX、8-LOX、12-LOX、15-LOX四種亞型。在脂質氧化過程中，首先由酶促途徑催化產(chǎn)生脂質過氧化物(lipid hydroperoxides，LOOHs)，隨后引發(fā)非酶促途徑的進一步代謝。LOXs、細胞色素P450氧化還原酶(cytochrome P450 oxidoreductase，POR)和環(huán)氧合酶(cyclooxygenases，COXs)是脂質過氧化酶促途徑的關鍵酶。近年來，LOXs因其精確的區(qū)域選擇性和多樣的作用位點選擇性具有較高的研究價值。12/15-脂氧合酶(12/15 lipoxygenase，12/15-LOX)是LOXs的一種亞型，也可總稱為ALOX15。ALOX15酶的中心位置是非血紅素鐵原子，并以配位鍵與3個組氨酸側鏈和羧基末端異亮氨酸結合，形成酶活力中心的主要組成部分。ALOX15的多肽鏈折疊形成了具有催化活性的C末端結構域和N末端具有β-barrel片段的結構域。ALOX15主要分為網(wǎng)狀細胞型(ALOX15)和表皮型(ALOX15-B)。其中，ALOX15-B具有巨噬細胞區(qū)域特異性，其在巨噬細胞中的表達明顯高于ALOX15，并參與調節(jié)巨噬細胞中的脂質代謝過程。目前，在冠心病發(fā)生與發(fā)展過程中，主要以對ALOX15的研究為主，而ALOX15與ALOX15-B究竟誰發(fā)揮更重要的作用仍有待深入研究。由此，本綜述主要對ALOX15與冠心病發(fā)病機制進行總結。

2.2 ALOX15調控磷脂過氧化(鐵死亡)對心肌的損傷隨著研究的深入，ALOX15在冠心病中的作用機制也被逐漸發(fā)掘，已經(jīng)不僅僅局限于誘發(fā)炎癥機制方面的研究，而在磷脂過氧化方面也嶄露頭角。目前認為，磷脂過氧化主要由酶介導和非酶介導兩大途徑產(chǎn)生，這也是鐵死亡的關鍵的機制。有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠心臟缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷時，Nrf2/Hmox1軸介導的線粒體鐵積累和磷脂過氧化能夠引發(fā)心肌細胞發(fā)生鐵死亡[1]。當心肌細胞缺乏鐵蛋白H(ferritin H)時，鐵死亡關鍵調節(jié)蛋白Slc7a11表達降低，攝入過量鐵離子可以通過降低谷胱甘肽含量，累積的過氧化磷脂增敏了心肌對鐵死亡的易感性[2]。基于此，我們發(fā)現(xiàn)鐵死亡對心肌損傷的研究主要聚焦于鐵代謝途徑方面，主要是由芬頓反應觸發(fā)，而對于酶介導的磷脂過氧化方面尚未有報道。LOXs與POR被認為可以通過酶促反應參與鐵死亡過程，其中LOXs被認為在鐵死亡中起核心作用，尤其是ALOX15。在動物模型中發(fā)現(xiàn)，ALOX15在冠心病早期已經(jīng)表達，且特定LOXs的代謝產(chǎn)物相較于冠心病晚期更為豐富，這可能與晚期的脂質過氧化更多由非酶促途徑介導相關[8]。因此，有研究者認為早期ALOX15介導的磷脂過氧化作用或許可以觸發(fā)后續(xù)的非酶促過程。但是，ALOX15具體是如何參與冠心病的疾病過程的具體機制仍不清楚。

從機制上來看，早期研究認為ALOX15主要氧化游離脂肪酸，產(chǎn)生過氧化花生四烯酸(arachidonic acid hydroperoxide，AA-OOH)，進而引發(fā)炎癥反應。近年來，研究者指出ALOX15的功能不僅表現(xiàn)在氧化游離脂肪酸，而且對膜結合的磷脂以及脂蛋白等都具有較高的特異性，其中膜磷脂可受到由ALOX15介導的磷脂過氧化攻擊并介導線粒體功能紊亂。不僅如此，因ALOX15對其氧化底物的獨特選擇性，可直接氧化含花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的磷脂，而無需事先通過磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)釋放酯化的AA。隨后，有研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰乙醇胺結合蛋白-1(phosphatidylethanolamine binding protein 1，PEBP1)作為ALOX15的伴侶分子可以將ALOX15鉚釘?shù)劫|膜后促使質膜中的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines，PE)產(chǎn)生過氧化損傷引發(fā)之后的鐵死亡[9]。進一步研究證實，膜PE氧化受ALOX15/PEBP1復合物的調控，并可引發(fā)更靈敏的酶促反應促進鐵死亡的發(fā)生[10](Fig 1)。與此同時，本課題組的研究證實了ALOX15可以加速鈣非依賴磷脂酶A2β(calcium-independent phospholipase A2β，iPLA2β)對膜磷脂酰乙醇胺氫過氧化物(phosphatidylethanolamines hydroperoxides，PE-OOH)的代謝促使AA-OOH堆積[11]?；诖?，我們發(fā)現(xiàn)ALOX15的早期研究主要關注的是其代謝產(chǎn)物在炎癥反應中的作用，卻忽略了ALOX15本身對磷脂氧化的作用。從冠心病的發(fā)展角度來看，炎癥確實是整個疾病發(fā)展的主要基礎，但是早期的生物膜磷脂的氧化損傷或許是炎癥發(fā)生的更重要起始元件。因此，深入研究ALOX15在磷脂過氧化過程中的調控機制或許有助于認識冠心病發(fā)病機理。

另一方面，ALOX15可以通過氧化修飾LDL引發(fā)冠心病。在動物實驗中，當機體缺失ALOX15，小鼠的心臟功能與LDL的氧化過程都得到了有效緩解；當機體過表達ALOX15，小鼠心臟功能明顯受損，加速斑塊形成，促進冠心病進程[12]。目前，對于ALOX15是如何介導LDL參與冠心病的作用尚不明確。有研究者認為，ALOX15介導的磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)與PE的氧化修飾是LDL氧化引發(fā)冠心病的重要發(fā)病機制[13]。為了闡明ALOX15與LDL氧化的具體機制，有研究將ALOX15與LDL共處理后發(fā)現(xiàn)，ALOX15易位至胞質膜通過脂蛋白受體相關蛋白(lipoprotein receptor-related proteins，LRPs)選擇性攝取和排出LDL最后介導了LDL的氧化[14](Fig 1)。此外，也有研究者認為，ALOX15先將LDL中的亞油酸鹽向膽固醇轉化，隨后在自由基連鎖反應下將LDL修飾為完全氧化狀態(tài)，最后導致泡沫細胞逐漸形成并參與冠心病發(fā)展過程[15](Fig 1)。最近，有研究發(fā)現(xiàn)在疾病狀態(tài)下，脂肪細胞中會存在鐵死亡[16]，而本課題組的另一項研究首次發(fā)現(xiàn)發(fā)生鐵死亡的細胞膜PE-OOH可作為一種“吃我”信號被巨噬細胞識別吞噬[17]。由此提示我們，若脂肪細胞發(fā)生鐵死亡產(chǎn)生大量PE-OOH引發(fā)巨噬細胞吞噬積累，或許可以促進泡沫細胞的形成，加速冠心病的進程。

此外，也有研究者提出不同的觀點，認為在缺氧條件下，ALOX15與其代謝產(chǎn)物12-HETE和15-HETE都對細胞有一定的保護作用，分別通過TRPV1/PKC通路降低心肌I/R損傷的敏感性和Ca2+依賴途徑增加了血管重塑[18]。由此可見，對于ALOX15及其代謝產(chǎn)物是導致心肌進一步損傷的原因，還是具有心肌保護作用，尚無確切定論。但是，鐵死亡的發(fā)現(xiàn)對冠心病研究者而言無疑是一道明亮的曙光。

3 ALOX15抑制劑的心肌保護作用

越來越多的證據(jù)表明，磷脂過氧化與冠心病的關系密切，尤其是ALOX15在冠心病發(fā)展過程的作用日益突出。因此，研究及開發(fā)ALOX15抑制劑并投入臨床應用對治療冠心病變得愈發(fā)重要。

3.1 ALXO15天然產(chǎn)物抑制劑與心肌損傷目前，天然產(chǎn)物中已被報道的ALOX15抑制劑主要包括黃酮類、多酚類、香豆素類和木脂素類(Tab 1)。黃芩素是黃酮類化合物，是黃芩的主要成分之一，是一種ALOX15特異性抑制劑。黃芩素(baicalein)不僅可以通過ERK1/2、AKT、p38 MAPK、JNK1/2及NF-kB/p65等信號通路緩解心肌的I/R損傷，還可通過casepase3通路、核因子E2相關因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶1(HO-1)及IκBα信號通路緩解心肌的凋亡、炎癥反應和脂質過氧化損傷[19]。不僅如此，抑制ALOX15與AA介導的線粒體去極化也是黃芩素緩解心肌I/R損傷的重要機制之一[20](Fig 2)。槲皮素(quercetin)是一種具有多種生物活性的黃酮醇類化合物，具有較強的抗氧化性，可顯著降低ALOX15的酶活性，并可以抑制由ALOX15介導的LDL氧化，在延緩冠心病進展中表現(xiàn)出較好的作用。此外，槲皮素還可以通過AMPK介導的凋亡信號通路緩解心肌細胞缺氧損傷[21-22](Fig 2)。

Tab 1 ALOX15 inhibitors

姜黃素(curcumin)是一種多酚類化合物，主要存在于姜科和天南星科的植物中，是LOXs的非選擇性抑制劑，對ALOX15具有一定的抑制作用。姜黃素可以通過抑制AA與血小板磷脂的結合、減少血栓烷、減少ox-LDL來延緩動脈粥樣硬化病變，進而減緩冠心病的發(fā)病進程[23]。同時，也有研究報道發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以調節(jié)Nrf2-Keap1信號通路發(fā)揮抗凋亡的作用，緩解心肌細胞死亡[24](Fig 2)。兒茶素(catechin)是一種多酚類化合物，主要存在于茶葉中，又稱為兒茶酸。有研究報道認為，兒茶素不僅可以通過降低血漿中TC和TG的水平來降低冠心病的風險，還可以通過抑制鐵促進的反應來預防心肌膜發(fā)生磷脂過氧化損傷[25]。此外，兒茶素可以顯著緩解由I/R引起的心肌細凋亡[26](Fig 1)。

七葉亭(esculetin)是一種香豆素類化合物，是12-LOX的有效抑制劑，可以通過調節(jié)JAK2/STAT3信號通路緩解I/R介導的心肌凋亡，并且對心肌有抗脂質過氧化及穩(wěn)定膜結構等作用[27](Fig 1)。

咖啡酸苯乙酯(CAPE)是一種木質素類化合物，主要存在于蜂膠中，是一種非選擇性ALOX15抑制劑。CAPE可緩解心肌I/R損傷，而且對阿霉素誘導的心臟毒性也有較好的降解作用[28](Fig 2)。去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)是一種木質素類化合物，廣泛存在于含樹脂的植物中，是非選擇性的LOX抑制劑。NDGA可以通過抑制MCP-1緩解缺氧引發(fā)的血栓形成，以及Ca2+途徑介導的心肌細胞凋亡[18](Fig 1)。

Fig 2 Mechanism of ALOX15 inhibitors

3.2 ALXO15化學合成抑制劑與心肌損傷基于多種結構類型的天然產(chǎn)物展現(xiàn)了良好的ALOX15抑制活性，為尋找其更為有效的抑制劑提供了潛在的先導化合物。目前，一些化學合成的ALOX15抑制劑也展現(xiàn)出了令人滿意的優(yōu)化效果。PD-146176是ALOX15的有效選擇性抑制劑之一，該化合物可以抑制高膽固醇血癥誘導的冠心病發(fā)病進程[29]。另外，LOXBlock-1作為一種新型的ALOX15抑制劑在心肌I/R損傷中也表現(xiàn)出了較好的作用[30]。ML-355作為一種選擇性12-LOX抑制劑，可通過抑制血小板的聚集，減少血栓形成，進而防止心血管不良事件的發(fā)生(Fig 1)。雖然對ALOX15抑制的研發(fā)仍處于初始階段，但隨著心肌損傷病理機制的逐漸提示，其特效抑制劑在臨床的應用指日可待。

4 總結與展望

冠心病是一個復雜的病理過程，盡管近些年來在其發(fā)病機制領域已取得了重要進展，但磷脂過氧化這一現(xiàn)象在疾病發(fā)展過程中的具體作用仍需要進一步研究。本課題組一直致力于研究ALOX15在冠心病中的機制，發(fā)現(xiàn)冠心病的危險因素——高血脂會改變心肌中脂肪酸比例，促使不飽和脂肪酸增加，從而觸發(fā)磷脂過氧化，最終引發(fā)對冠心病心肌損傷的易感性增加。但是，我們的研究只是冠心病復雜機制中的冰山一角，仍有許多機制未闡明。例如：磷脂過氧化是由心肌細胞膜引起還是LDL表面磷脂所引起；心肌細胞膜磷脂過氧化損傷與LDL的氧化是否存在先后順序及上下游關系；以及ALOX15介導的磷脂過氧化在冠心病中是否具有一定的特異性。鐵死亡的提出無疑給這些研究領域提供了方向，本課題組也一直致力于鐵死亡對疾病機制與ALOX15抑制劑開發(fā)方面的研究，并寄希望于此能為認識及防治冠心病提供證據(jù)。