楊佳樂，沈祥春

(貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州省特色天然藥物資源高效利用工程研究中心，貴州 貴陽 550025)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性多因素疾病，與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中內(nèi)皮功能障礙是導(dǎo)致As的始動因素[1]。NLRP3炎癥小體是由受體蛋白(NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶1前體(pro-caspase-1)組成的多蛋白復(fù)合物，激活后參與IL-1β和IL-18的活化與釋放，并介導(dǎo)細胞焦亡[2]。細胞焦亡又稱細胞炎性壞死，是一種程序性細胞死亡，由GasderminD蛋白(GSDMD)介導(dǎo)。研究表明[3]，在NLRP3炎癥小體激活后，受損的內(nèi)皮細胞釋放大量炎癥介質(zhì)，并誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙發(fā)生，最終促進As進展。同時[4-5]，內(nèi)皮細胞中激活的NLRP3炎癥小體通過介導(dǎo)GSDMD活化，引起細胞膜孔的形成，進而發(fā)生細胞焦亡，從而加速內(nèi)皮細胞丟失并導(dǎo)致心血管疾病。NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的pro-caspase-1激活是誘發(fā)細胞焦亡和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵機制之一[6]。因此，抑制pro-caspase-1的激活，可以有效降低細胞炎癥和細胞焦亡的發(fā)生，從而改善內(nèi)皮功能障礙，為治療心血管疾病提供作用靶點。

燈盞花乙素(scutellarin，Scu)是一種天然黃酮類活性成分，具有抗炎[7-8]、抗癌[9-10]、抗氧化[11-12]等多種藥理作用。研究表明[13-14]，Scu對肺上皮細胞、心肌細胞中NLRP3、pro-caspase-1、ASC的表達具有調(diào)節(jié)作用，通過抑制NLRP3炎癥小體激活，顯著減少炎癥因子活化水平并改善細胞焦亡?；谏鲜鲅芯?，探索Scu對血管內(nèi)皮細胞炎癥損傷和細胞焦亡的改善作用，將為篩選動脈粥樣硬化治療藥物提供潛在目標(biāo)。因此，該文以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為對象，通過LPS+ATP誘導(dǎo)建立炎癥模型，探討Scu對內(nèi)皮細胞炎癥損傷和細胞焦亡的調(diào)節(jié)作用和分子機制，為進一步臨床實驗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVCEs)購自ScienCell公司。

1.1.2藥品與試劑 Scu(0329)購自上海瑞楚生物科技有限公司；Endothelial cell medium(ECM，1001)購自Sciencell technology；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(L2880)和腺苷5′-三磷酸二鈉鹽水合物(ATP)(A2383)購自美國Sigma公司；pan-caspase抑制劑Z-YVAD-FMK(HY-P1009)購自MCE公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(103)購自美國Solarbio公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒(A020-2)購自南京建成生物工程研究所；NLRP3抗體(DF7438)、caspase-1抗體(AF5418)、cleaved-caspase-1(Asp296)，p20抗體(AF4005)和GSDMD抗體(AF4013)購自Affinity公司；ASC抗體(YT0365)購自Immunoway公司。caspase-1和GAPDH的qRT-PCR引物購自Invitrogen公司。

1.1.3主要儀器 HF240型二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2F單人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；Nikon ECLIPSE TS100-F(日本尼康公司)；JT74-2晶體管鼓風(fēng)電熱恒溫箱(浙江余姚低塘恒溫箱廠)；ELX800型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國GE公司)；CFX型凝膠成像系統(tǒng)、Mini-Protean Tetra電泳槽、Power Pace Basic基礎(chǔ)電源、Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1原代細胞培養(yǎng) 復(fù)蘇后將HUVCEs細胞培養(yǎng)于ECM培養(yǎng)基中(雙抗占總體積1%、血管內(nèi)皮生長因子占總體積1%、胎牛血清占總體積5%)，放置于含5% CO2、溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每隔1 d更換1次培養(yǎng)基，通過顯微鏡觀察，當(dāng)細胞占瓶底90%后進行傳代。4～7代HUVCEs可收集用于實驗。

1.2.2實驗分組及處理 本研究分為藥效和抑制劑兩部分，藥效實驗分組為：Control組、LPS+ATP組(2.5 mg·L-1LPS+2.5 mmol·L-1ATP)、LDG組(0.2 μmol·L-1Scutellarin+2.5 mg·L-1LPS+2.5 mmol·L-1ATP)、MDG組(1 μmol·L-1Scutellarin+2.5 mg·L-1LPS+2.5 mmol·L-1ATP)、HDG組(5 μmol·L-1Scutellarin+2.5 mg·L-1LPS+2.5 mmol·L-1ATP)。除Control組外，各組給予不同濃度的Scu預(yù)保護1 h后，加入LPS進行5.5 h活化，再加入ATP共同孵育0.5 h，結(jié)束后根據(jù)實驗設(shè)計進行相應(yīng)處理。抑制劑實驗分組為：Control組、LPS+ATP組(2.5 mg·L-1LPS+2.5 mmol·L-1ATP)、HDG組(5 μmol·L-1Scutellarin+2.5 mg·L-1LPS+2.5 mmol·L-1ATP)、YVAD組(1 μmol·L-1Z-YVAD-FMK)、LAY組(1 μmol·L-1Z-YVAD-FMK+2.5 mg·L-1LPS+2.5 mmol·L-1ATP)、LAYH組(1 μmol·L-1Z-YVAD-FMK+5 mmol·L-1Scutellarin+2.5 mg·L-1LPS+2.5 mmol·L-1ATP)。除Control組外，各組給予Scu或Z-YVAD-FMK預(yù)保護1 h后，加入LPS進行5.5 h活化，再加入ATP共同孵育0.5 h，結(jié)束后根據(jù)實驗設(shè)計進行相應(yīng)處理。

1.2.3MTT實驗檢測細胞活力 以1×105個·L-1密度的細胞接種于96孔板中，依據(jù)分組處理細胞后，采用MTT法檢測細胞活力。計算公式：細胞存活率/%=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.4乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗檢測細胞的毒性損傷 以1×105個·L-1密度的細胞接種于96孔板中，依據(jù)分組處理細胞并收集各組上清液，經(jīng)離心后根據(jù)LDH檢測試劑盒使用說明書進行操作，檢測各組細胞上清液中LDH的含量。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測炎癥因子的釋放 以1×108個·L-1密度的細胞接種于96孔板中，依據(jù)分組處理細胞并收集各組上清液，經(jīng)離心后根據(jù)ELISA檢測試劑盒使用說明書進行操作，檢測各組細胞上清液中IL-1β、IL-18、HMGB-1的含量。

1.2.6免疫印跡(Western blot，WB)法檢測相關(guān)蛋白表達 依據(jù)分組處理細胞后收集細胞，加入細胞裂解液(PMSF 1% ∶RIPA 99%)，冰上裂解30 min后提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測進行定量。經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后，采用濕轉(zhuǎn)法將已分離的蛋白轉(zhuǎn)移0.22 μm PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入目標(biāo)一抗后置于4 ℃冰箱孵育過夜。1×TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育2 h。通過CFX型凝膠成像系統(tǒng)進行顯影和數(shù)據(jù)分析。

1.2.7qRT-PCR(quantitative real time PCR)法檢測相關(guān)mRNA表達 分組處理細胞后收集細胞，根據(jù)TransZol Up Plus RNA Kit 試劑盒使用說明書提出總mRNA，利用超微量紫外分光光度儀測定mRNA濃度。根據(jù)TransScript Frist-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒使用說明書，以mRNA為模板，合成cDNA。用目的基因設(shè)計引物，利用Universal Hood II型實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行擴增和檢測。PCR引物序列見Tab 1，其中GAPDH為內(nèi)參。

Tab 1 Primer used for quantitative real time PCR

2 結(jié)果

2.1 Scu對LPS+ATP誘導(dǎo)細胞毒性損傷的影響MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，LPS+ATP組可明顯降低細胞活力(P<0.01)。與LPS+ATP組比較，給予Scu預(yù)保護后，細胞活性隨給藥濃度提升而增加，其中HDG組最顯著(P<0.01)，如Fig 1A所示。

檢測細胞上清中LDH含量，與Control組比較，LPS+ATP組細胞上清中LDH含量顯著增加(P<0.01)；與LPS+ATP組比較，給予Scu預(yù)保護后，LDH含量逐漸降低，其中HDG組最明顯(P<0.01)，如Fig 1B所示。結(jié)果說明，Scu可濃度依耐性改善LPS+ATP誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞毒性損傷。

2.2 Scu對NLRP3炎癥小體組成蛋白NLRP3、ASC和pro-caspase-1表達的影響與Control組比較，LPS+ATP組細胞中NLRP3、ASC和pro-caspase-1的表達明顯增加(P<0.01)；與LPS+ATP組比較，給予Scu預(yù)保護后，細胞中NLRP3、ASC和pro-caspase-1的表達梯度減少，其中HDG組最明顯(P<0.01)，如Fig 2所示。結(jié)果說明Scu呈劑量依賴性抑制內(nèi)皮細胞中炎癥小體的產(chǎn)生。

2.3 Scu對LPS+ATP誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化的影響內(nèi)源性刺激因子ATP可以誘導(dǎo)細胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的活化，caspase-1 p20的產(chǎn)生和成熟的IL-1β、IL-18釋放是NLRP3炎癥小體活化的標(biāo)志。通過western blot法對細胞中caspase-1 p20檢測，與Control組比較，LPS+ATP組的caspase-1 p20表達增加(P<0.01)；與LPS+ATP組比較，給予Scu預(yù)保護后呈濃度依賴性減少(P<0.05)，如Fig 3A所示。通過ELISA法檢測細胞上清中IL-1β、IL-18含量，與Control組比較，LPS+ATP組的IL-1β、IL-18含量增加(P<0.01)；與LPS+ATP組比較，給予Scu預(yù)保護后呈濃度依賴性減少(P<0.05)，如Fig 3B所示。結(jié)果說明，Scu通過降低caspase-1p20的產(chǎn)生和IL-1β、IL-18的釋放，抑制LPS+ATP誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞中NLRP3炎癥小體的活化。

Fig 1 Effect of Scu on LPS+ATP induced

Fig 2 Effect of Scu on expression of NLRP3 inflammasome related proteins including NLRP3，ASC and

Fig 3 Effect of Scu on LPS+ATP induced NLRP3

2.4 Scu對LPS+ATP誘導(dǎo)細胞焦亡的影響NLRP3炎癥小體活化可介導(dǎo)焦亡效應(yīng)蛋白GSDMD-NT的產(chǎn)生，誘使細胞發(fā)生焦亡并向胞外釋放HMGB-1。通過Western blot法對細胞中GSDMD-NT檢測，與Control組比較，LPS+ATP組的GSDMD-NT表達增加(P<0.01)；與LPS+ATP組比較，給予Scu預(yù)保護后呈濃度依賴性減少，其中HDG組最明顯(P<0.01)，如Fig 4A所示。通過ELISA法檢測細胞上清中HMGB-1含量，與Control組比較，LPS+ATP組的HMGB-1含量增加(P<0.01)；與LPS+ATP組比較，給予Scu預(yù)保護后呈濃度依賴性減少，其中HDG組最明顯(P<0.01)，如Fig 4B所示。結(jié)果說明，Scu通過降低GSDMD-NT的產(chǎn)生和HMGB-1的釋放，抑制LPS+ATP誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞焦亡。

Fig 4 Effect of Scu on LPS+ATP induced

2.5 Scu 通過抑制pro-caspase-1的生成和活化改善LPS+ATP誘導(dǎo)HUVECs的炎癥反應(yīng)和細胞焦亡pro-caspase-1的活化可以介導(dǎo)IL-1β、IL-18的成熟釋放和GSDMD-NT的生成，從而引起細胞炎癥損傷和焦亡的發(fā)生。pan-caspase抑制劑Z-YVAD-FMK可以抑制pro-caspase-1的活化，以caspase-1 p20/ pro-caspase-1比值體現(xiàn)。通過Western blot法對細胞中pro-caspase-1、caspase-1 p20、GSDMD-NT檢測，與LPS+ATP組比較，LAY組和LAYH組的caspase-1 p20/ pro-caspase-1比值均降低(P<0.05)，且二者差異無顯著性(P>0.05)，如Fig 5A所示。與LPS+ATP組比較，LAY組和LAYH組的GSDMD-NT表達均降低(P<0.05)，且二者無差異(P>0.05)，如Fig 5A所示。與LPS+ATP組比較，LAY組caspase-1p20表達無顯著差異，LAYH組表達降低(P<0.05)，如Fig 5A所示。通過ELISA法檢測細胞上清中IL-1β、IL-18、HMGB-1含量，與LPS+ATP組比較，LAY組和LAYH組的含量表達均降低(P<0.05)且二者無差異(P>0.05)，如Fig 5B所示。通過PCR檢測caspase-1mRNA表達水平，與LPS+ATP組比較，LAY組無差異，LAYH組表達降低(P<0.05)，F(xiàn)ig 5C所示。結(jié)果說明，通過抑制pro-caspase-1的生成和活化，Scu對LPS+ATP誘導(dǎo)HUVECs的炎癥損傷和細胞焦亡發(fā)揮改善作用。

Fig 5 Scu improved inflammation and pyroptosis in LPS+ATP induced HUVECs by inhibiting activation of

3 討論

NLRP3炎癥小體參與內(nèi)皮細胞損傷的發(fā)生和發(fā)展過程[15]，并通過介導(dǎo)細胞焦亡進一步誘導(dǎo)心血管疾病的發(fā)生[16]。研究表明[17]，當(dāng)細胞中NLRP3炎性小體途徑被激活，相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、pro-caspase-1表達增加。隨著炎癥小體被組裝活化，結(jié)構(gòu)改變的NLRP3炎性小體誘導(dǎo)pro-caspase-1激活。Pro-caspase-1激活是細胞炎癥反應(yīng)和焦亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，一方面，激活的caspase-1對Gasdermin D進行剪切，形成含有Gasdermin D氮端活性結(jié)構(gòu)域的多肽(GSDMD-NT)。這種反應(yīng)會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞膜破裂，內(nèi)容物釋放并引起炎癥反應(yīng)，同時內(nèi)皮的完整性喪失。另一方面，pro-IL-1β和pro-IL-18被激活的caspase-1裂解為成熟的IL-1β和IL-18，并將它們釋放到細胞外，招募炎癥細胞并導(dǎo)致炎癥細胞積聚，從而放大炎癥。本研究結(jié)果顯示，與LPS+ATP組比較，Scu組能降低內(nèi)皮細胞中NLRP3、ASC、pro-caspase-1表達，表明其對NLRP3炎性小體生成具有抑制作用。同時減少IL-1β、IL-18、HMGB-1的釋放和降低細胞焦亡相關(guān)蛋白GSDMD-NT的表達，表明對NLRP3炎性小體誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥損傷和細胞焦亡具有改善作用。和Scu /Z-YVAD-FMK聯(lián)用組相比，Scu組對pro-caspase-1活化無差異，但能減少caspase-1 mRNA的表達，進一步說明Scu可以同時抑制pro-caspase-1的蛋白生成和活化。

綜上所述，Scu能改善血管內(nèi)皮細胞損傷，其機制是通過下調(diào)NLRP3/caspase-1通路，減少IL-1β、IL-18、HGBM-1的釋放，改善內(nèi)皮細胞的炎癥損害，同時抑制GSDMD活化，減弱細胞焦亡的發(fā)生，從而達到進一步減輕內(nèi)皮細胞損傷的作用。