呂子陽，任歡歡，聶盛丹，王 珊

(1. 中南大學化學化工學院制藥工程系，湖南 長沙 410083；2. 湖南省人民醫(yī)院藥物臨床試驗機構(gòu)辦，湖南 長沙 410000)

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種進化保守的生物學過程，通過降解靶信使RNA(messenger RNA, mRNA)選擇性地抑制基因的表達[1]。RNAi在癌癥、感染、自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病的治療中都展現(xiàn)出巨大的潛力[2]。引入外源性合成的小干擾RNA(small interfering, siRNA)，通過特定的堿基互補配對可以誘導RNAi的發(fā)生。然而，siRNA在實際應(yīng)用中存在許多問題，如：siRNA穩(wěn)定性較差，在血液中易被降解；分子量相對較小，即使是經(jīng)過化學修飾能在血液中保持穩(wěn)定的siRNA分子也易經(jīng)尿液排泄；缺少靶向性，體內(nèi)的隨機分布易造成不必要的毒性；固有的負電性導致很難被細胞內(nèi)化。到目前為止，將siRNA遞送到靶組織/靶細胞并發(fā)揮基因沉默作用仍然是極具挑戰(zhàn)的事情。

許多靶向配體，如多肽、蛋白、親脂性分子已經(jīng)被用來靶向傳遞siRNA。核酸適配體(aptamer)又稱為“化學抗體”，特定的三維空間結(jié)構(gòu)賦予了其與細胞表面蛋白的高度親和力，而這種細胞特異性的核酸適配體可以用來遞送抗癌藥物、酶、核酸到靶細胞中。核酸適配體可以直接與siRNA共價結(jié)合構(gòu)建核酸適配體-siRNA嵌合體，或者作為一個靶向配體與其他siRNA載體連接來引導其進入靶細胞。近年來，已有大量研究證明，核酸適配體作為靶向配體引導siRNA進入靶細胞的可能性，許多核酸適配體也成功實現(xiàn)了在體內(nèi)靶向遞送siRNA[3-5]。該綜述總結(jié)了近幾年核酸適配體靶向遞送siRNA在疾病治療中的設(shè)計策略及應(yīng)用的最新研究進展，并討論了核酸適配體介導siRNA傳遞在臨床轉(zhuǎn)化方面的挑戰(zhàn)與前景，以期為siRNA藥物的靶向遞送提供一定的參考。

1 核酸適配體作為靶向配體遞送siRNA的優(yōu)點

與傳統(tǒng)抗體相比，核酸適配體作為靶向傳遞配體有著許多吸引人的地方。首先，核酸適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化(systemic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)的選擇方法從隨機分子庫合成得到的一段短的單鏈DNA或RNA分子，與抗體生產(chǎn)的復雜昂貴、冗長的體內(nèi)篩選相比，這種SELEX的體外篩選方法能在幾周內(nèi)篩選出能夠靶向目的配體的核酸適配體。其次，由于核酸適配體是在完全體外環(huán)境依賴化學合成制造的，生產(chǎn)批次之間的差異更小，不存在或存在更低的污染風險。再次，與體積較大的抗體(150～180 ku, 直徑～15nm)相比，核酸適配體的尺寸較小( 6～30 ku, 直徑1～2 nm)，免疫原性更低，結(jié)構(gòu)更靈活，可以與更小的靶標或者一些隱藏的結(jié)合區(qū)域結(jié)合[6]。最重要的是，小體積的核酸適配體表現(xiàn)出較強的組織滲透性，特別是在實體腫瘤中，這非常有利于遞送藥物到深層的組織細胞內(nèi)。到目前為止，許多的臨床前研究已經(jīng)證明了核酸適配體靶向遞送siRNA的潛力[3-4, 7]。

2 基于核酸適配體-siRNA嵌合體靶向遞送siRNA

核酸適配體和siRNA都為核酸，很容易通過共價連接或者堿基互補配對的方式結(jié)合形成核酸適配體-siRNA嵌合體。2006年，Sullenger研究團隊[8]首次用靶向前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen, PSMA)的核酸適配體與PLK1和BCL2 siRNA的正義鏈共價連接構(gòu)建核酸適配體-siRNA嵌合體。其中，PSMA是一種在只在前列腺癌細胞和腫瘤血管內(nèi)皮中過度表達的細胞表面受體，PLK1和BCL2基因在人類多種癌癥中過表達且與癌細胞的生存相關(guān)。當該嵌合體應(yīng)用于PSMA+細胞時，這些RNA能被Dicer酶加工，siRNA從嵌合體上分離并與特異性酶Argo-2蛋白等(包括核酸內(nèi)切酶、外切酶、螺旋酶等)形成RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex, RISC)，在ATP-依賴的解螺旋酶作用下，siRNA雙鏈打開，正義鏈離去，反義鏈激活RISC，再與互補序列的靶mRNA的同源區(qū)特異性結(jié)合，通過酶的作用使mRNA降解，從而達到基因沉默的作用。并且，該核酸適配體-siRNA嵌合體的基因沉默效率與傳統(tǒng)的陽離子脂質(zhì)體介導的siRNA轉(zhuǎn)染相媲美。然而，由于該嵌合體的穩(wěn)定性較差，因此只能通過瘤內(nèi)注射來驗證其體內(nèi)的治療效果[8]。

為提高核酸適配體-siRNA嵌合體的穩(wěn)定性，將其應(yīng)用于體內(nèi)實驗，可對核酸適配體和siRNA部分進行化學修飾，如對核酸適配體3′端和/或5′端進行修飾來抵抗核酸外切酶的水解作用；用氟、氨基、甲氧基等取代核酸適配體骨架的核糖或脫氧核糖的2′位氫，或?qū)⒘姿岫ユI修飾為硫代磷酸二酯鍵可抵抗核酸內(nèi)切酶的進攻[9]；此外，鎖核酸技術(shù)和鏡像技術(shù)亦可增加核酸適配體的穩(wěn)定性。近來已有大量研究報道了基于構(gòu)建核酸適配體-siRNA嵌合體靶向遞送siRNA用于疾病治療。

信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcriptional-3, STAT3)的異常表達和激活在白血病、結(jié)腸癌、腎癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，是潛在的治療靶點。Gint4.T是由33個堿基組成的RNA適配體，能夠特異性結(jié)合并拮抗血小板衍生生長因子受體β(platelet-derived growth factor receptor β，PDGFRβ)。Esposito等[3]通過化學的方法在Gint4.T的3′端融合4個—(CH2)3—作為linker，隨后在linker后共價連接一段17個堿基的隨機序列作為的粘性末端，通過堿基互補配對與接有17個未配對堿基的STAT3 siRNA反義鏈構(gòu)建Gint4.T-siRNA嵌合體。將Gint4.T和STAT3 siRNA嘧啶堿基或嘌呤2′位進行氟修飾或甲氧基修飾，修飾后的嵌合體能夠在含80%人血清至少能穩(wěn)定存在24 h以上。體外實驗中，該嵌合體能高效傳遞siRNA到PDGFRβ+膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中誘導STAT3基因沉默，抑制細胞的增殖和遷移；體內(nèi)實驗中，即使經(jīng)腹腔注射該嵌合體，也能夠抑制皮下荷瘤小鼠腫瘤的生長和血管生成。

HER家族由表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、HER1(EGFR)、HER2、HER3、 HER4組成，它們之間相互依賴，一個HER受體的阻斷通常可以由另一個HER家族成員來補償[10]。其中EGFR、HER2、 HER3促進許多癌癥起始和發(fā)展，尤其在乳腺癌中，是公認的治療靶點[11]。Liu等[4]采用HER2核酸適配體和HER3核酸適配體作為靶頭，將EGFR siRNA嵌入到兩個核酸適配體中間構(gòu)建HER2-EGFR siRNA-HER3核酸適配體嵌合體(H2EH3)。在核酸適配體和siRNA之間插入2～4個未配對的腺嘌呤核糖核苷酸，為每個核酸適配體提供空間靈活性，并在EGFR siRNA反義鏈的3′端融合2個核苷酸促進RISC的形成[12]。結(jié)果顯示，EGFR siRNA能有效通過HER2/HER3核酸適配體誘導的內(nèi)化作用進入HER2+細胞并發(fā)揮基因沉默作用。巧妙的是，在H2EH3中，HER2/HER3核酸適配體一方面可作為siRNA靶向遞送的載體；另一方面可作為HER2和HER3信號通路的拮抗劑，下調(diào)EGFR、 HER2、 HER3三種受體的表達，觸發(fā)細胞凋亡。H2EH3的分子量約為55.4 ku，大于腎小球的截留分子量(30～50 ku)，但小于抗體的分子量(～150 ku)，因此在體內(nèi)不易被截留。在乳腺癌異種移植模型中，經(jīng)靜脈或瘤內(nèi)給藥后，H2EH3高特異性結(jié)合乳腺癌細胞并抑制腫瘤生長。

細胞上皮黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)是一種糖基化的1型膜蛋白。在正常上皮細胞中，EpCAM僅在基底外側(cè)間隙連接上低表達；而在大多數(shù)實體腫瘤中，EpCAM的表達量高于正常細胞數(shù)個數(shù)量級，且沿細胞膜分布。并且，EpCAM的連接能夠促進細胞的粘附，增強細胞的增殖和侵襲[13]。Lieberman研究團隊[5]采用EpCAM核酸適配體作為靶頭，攜帶可促進腫瘤新抗原表達(Upf2、 Parp1、 Apex1)，吞噬和抗原呈遞(Cd47)、減少檢查點抑制(Cd274)或?qū)е履[瘤細胞死亡(Mcl1)為靶點基因的siRNA，以敲除EpCAM+腫瘤細胞特定基因使腫瘤細胞更易被免疫系統(tǒng)察覺。EpCAM核酸適配體與siRNA的正義鏈5′端通過U—U—U linker共價連接形成核酸適配體-siRNA嵌合體。將嘧啶進行2′氟修飾，siRNA的3′端連接兩個dTdT突出端，以增強其在體內(nèi)的穩(wěn)定性并降低脫靶效應(yīng)。該嵌合體基因沉默效果在三陰性乳腺癌、HER2+原位、轉(zhuǎn)移性和基因工程小鼠乳腺癌模型中都得到了驗證。6種嵌合體中的4個(Upf2、 Parp1、 Cd47、 Mcl1)能有效抑制腫瘤生長并促進腫瘤浸潤免疫細胞的功能。此外，多種混合嵌合體比單獨的嵌合體更有效，并能與抗PD-1檢查點抑制協(xié)同發(fā)揮作用。總的來說，該核酸適配體-siRNA嵌合體為腫瘤免疫治療開辟了新思路。

盡管核酸適配體-siRNA嵌合體能夠靶向傳遞并敲除目的基因，但是正常組織中的非特異性積累減少了病理組織中核酸適配體和siRNA的有效積累和釋放，這可能降低治療效果，產(chǎn)生不良影響，因此需要更精準的siRNA釋放位點和可控的釋放時間節(jié)點。Huang等[14]提出了一種光觸發(fā)核酸適配體納米開關(guān)用于siRNA傳遞的時空調(diào)控。該研究采用AS1411適配體與Polo樣激酶1(polo-like kinase 1, PLK1)siRNA的正義鏈3′端共價連接組成核酸適配體-siRNA嵌合體，用光敏感的寡核苷酸(photo-sensitive oligonucleotide, OliP)與AS1411配對以調(diào)節(jié)AS1411的空間結(jié)構(gòu)。與此同時，對siRNA的某些核苷酸的2′位進行甲氧基修飾賦予siRNA核酸酶抗性。結(jié)果顯示，在細胞實驗中，在沒有紫外光(ultraviolet, UV)照射的情況下，OliP與AS1411的配對阻斷了AS1411識別核仁素并介導的內(nèi)化功能，導致嵌合體無法有效進入細胞誘導PLK1基因沉默；而在有UV的情況下，OliP被光降解使AS1411的靶向識別核仁素的功能重新激活，其基因沉默效率與單獨的核酸適配體-siRNA相當。在小鼠體內(nèi)實驗中，接有OliP的核酸適配體-siRNA在沒有UV的情況下只有少量在腫瘤聚集；而在UV照射小鼠腫瘤的情況下，接有OliP的核酸適配體-siRNA在腫瘤富集的熒光強度甚至比單獨的核酸適配體-siRNA更強?？偟膩碚f，該方法為復雜的生物系統(tǒng)中的精確有效傳遞提供了一個多功能且強大的平臺。

3 核酸適配體聯(lián)合納米載體靶向遞送siRNA

盡管核酸適配體-siRNA嵌合體在靶向遞送siRNA方面具有免疫原性低、易于化學修飾等優(yōu)點，但是低效的細胞質(zhì)傳遞、核內(nèi)體逃逸限制了其臨床轉(zhuǎn)化。將裝載有siRNA的納米載體結(jié)合核酸適配體用于靶向遞送siRNA有以下優(yōu)勢：首先，核酸適配體結(jié)合的納米載體能夠?qū)⑵溲b載的“貨物”特異性地聚集到靶細胞中；其次，納米載體可以穩(wěn)定地封裝siRNA，保護siRNA不被酶降解；再次，納米材料可以促進siRNA的胞質(zhì)傳遞，并且可以改善siRNA的藥代動力學，如延長siRNA的血液循環(huán)；最后，納米材料可以融入額外的治療成分和探針以實現(xiàn)協(xié)同治療和分子成像。目前已有大量研究聯(lián)合核酸適配體和納米材料遞送siRNA到特定的細胞/組織中。本章將主要介紹核酸適配體聯(lián)合脂質(zhì)體、天然生物膜囊泡、球形納米顆粒、RNA/DNA納米顆粒用于靶向遞送siRNA在設(shè)計和治療方面的最新進展。

3.1 核酸適配體聯(lián)合脂質(zhì)體靶向遞送siRNA脂質(zhì)體是一種具有雙層結(jié)構(gòu)的球形囊泡，基于其優(yōu)越的生物相容性、生物降解性、低毒性、制備工藝簡單等優(yōu)點，常被作為載體被廣泛用于科學研究和臨床實驗。Park等[15]在聚乙二醇化陽離子脂質(zhì)體的雙分子層中插入疏水性的量子點(quantum dots, QDs)用于實時成像，將治療性的siRNA(BCL-2和PKC-ι)與脂質(zhì)體絡(luò)合形成量子點脂質(zhì)納米載體(QD-lipid nanocarriers, QLs)，最后將EGFR核酸適配體偶聯(lián)到脂質(zhì)體上使其特異性靶向三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)。結(jié)果顯示，與非靶向的對照QLs相比，靶向EGFR的QLs顯示出對癌細胞更有效的基因沉默和增強的腫瘤成像。此外，同時將BCL-2和PKC-ιsiRNA裝載到靶向EGFR的QLs中，可顯著抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移?？偟膩碚f，在相同的實驗條件下，靶向EGFR的QLs表現(xiàn)出更強的體內(nèi)遞藥和治療效果，表明靶向EGFR的QLs可能是一種能同時用于TNBC的RNA干擾和熒光成像的治療載體。

盡管陽離子脂質(zhì)體表現(xiàn)出較好的siRNA遞送效率，但是也存在許多局限性：如容易在血液中聚集，易被腎小球截留，易被帶負電的蛋白質(zhì)吸附。Fattal等[16]將魚精蛋白肽縮合的LUC2 siRNA裝載到聚乙二醇化脂質(zhì)體中，并通過進一步酶解清除脂質(zhì)體的表面，然后將靶向CD44的核酸適配體與聚乙二醇化的磷脂結(jié)合，從而將核酸適配體嵌合到脂質(zhì)體上。其中魚精蛋白可以濃縮siRNA，以將其裝載到非陽離子聚乙二醇化脂質(zhì)體中，實現(xiàn)較高的siRNA裝載量。CD44是一種跨膜蛋白，在黏附、遷移、增殖、運動和分化等多種細胞途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是許多腫瘤包括TBNC的生物標志物。結(jié)果顯示，在體外細胞實驗中，核酸適配體功能化的非陽離子脂質(zhì)體對LUC2基因有較高沉默效率；在小鼠體內(nèi)實驗中，其有長時間的抑制作用?？傊?，該非陽離子脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)實現(xiàn)了對體內(nèi)表達CD44腫瘤細胞有效的基因沉默。

有效的溶酶體逃逸是目前核酸遞送系統(tǒng)亟待解決的問題，由于腫瘤組織較正常組織pH值更低，pH響應(yīng)傳遞一直是核酸遞送領(lǐng)域非常有前景的方法之一。pH響應(yīng)型脂質(zhì)體是一種具有細胞內(nèi)靶向和控制藥物，如基因、核酸、肽、蛋白質(zhì)釋放的功能性脂質(zhì)體。其原理是：在低pH條件下，脂肪酯羧基質(zhì)子化形成六角晶相結(jié)構(gòu)——膜融合的主要機制。在核內(nèi)體形成后幾分鐘內(nèi)，進入溶酶體之前，pH從7.4降低至5.3～6.3時，pH響應(yīng)型脂質(zhì)體膜發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，促使脂質(zhì)體膜與核內(nèi)體/溶酶體膜的融合，將包封的物質(zhì)導入胞質(zhì)及主動靶向病變組織，從而避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除。Bhattacharya等[17]采用pH響應(yīng)的棕櫚酰同型半胱氨酸的雙脂質(zhì)，TPHC；天然兩親性脂質(zhì)，1, 2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE)和基于膽固醇的雙陽離子脂質(zhì)，C5C，按照一定的摩爾比(THPC ∶DOPE ∶C5C=1 ∶24 ∶8)制成pH響應(yīng)型脂質(zhì)體，然后將DY647標記、膽固醇化的EpCAM核酸適配體嵌入到pH響應(yīng)型陽離子脂質(zhì)的疏水層使其能夠選擇性地將基因傳遞給EpCAM過表達的癌癥干細胞，其中的熒光染料可幫助實時監(jiān)控其內(nèi)化途徑。結(jié)果顯示，該pH響應(yīng)型脂質(zhì)體可在一定程度上避免溶酶體降解并增加包封藥物的攝取量和穩(wěn)定性，有效地將包封物轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)。

3.2 核酸適配體聯(lián)合天然生物膜囊泡靶向遞送siRNA外泌體(exosome)是直徑～100 nm的生物膜囊泡，相對較小的分子結(jié)構(gòu)，良好的生物相容性使其在藥物遞送領(lǐng)域富有巨大的潛力。近年來，已有許多研究將siRNA或小分子復合物融入到外泌體中用于治療癌癥等疾病，并取得了一定的療效。然而，由于外泌體缺乏靶向性和選擇性，這些外泌體可能會被其他細胞大量內(nèi)化，從而導致其他副作用和不必要的浪費。在外泌體表面修飾核酸適配體可以賦予其靶向性，從而降低這種副作用和不必要的浪費。Xia等[18]將SIRT6 siRNA電轉(zhuǎn)入外泌體，通過巰基-馬來酰亞胺交聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)外泌體和E3核酸適配體的共軛連接。其中SIRT6基因的表達與前列腺癌的發(fā)展呈正相關(guān)，敲除SIRT6能夠顯著抑制前列腺癌細胞株在體內(nèi)或體外的遷移；E3核酸適配體可特異性識別前列腺癌細胞而不識別正常細胞。結(jié)果顯示，無論是皮下腫瘤模型還是原位腫瘤模型，該載體都能夠有效敲除SIRT6基因抑制腫瘤的發(fā)展和遷移。Chen等[19]通過逐層自組裝的方式在間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)來源的外泌體上修飾聚乙烯亞胺/聚乙二醇(polyethylenimine/polyethylene glycol, PEI/PEG)共聚物并偶聯(lián)核酸適配體-siRNA嵌合體，從基因水平來誘導移植中的免疫耐受。該研究首先將帶正電荷的PEI/PEG共聚物自組裝到帶負電的生物囊泡上，然后將靶向樹突細胞特異性細胞間黏附分子-3-結(jié)合非整合素分子(dendritic cell-special intercellular adhesion molecule-3 grabbing nonintergrin, DC-SIGN)的核酸適配體-mTOR siRNA嵌合體偶聯(lián)到PEG上，構(gòu)建具有靶向性的外泌體遞藥系統(tǒng)。結(jié)果顯示，接有SIGN核酸適配體的外泌體大量被樹突細胞內(nèi)化，內(nèi)化細胞的mTOR siRNA能夠抑制免疫應(yīng)答。此外，該遞藥體系還可以通過電轉(zhuǎn)的方法將microRNA-148a，microRNA-148b和microRNA-152導入外泌體中誘導人白細胞抗原-G(human leucocyte antigen-G, HLG-A)持續(xù)表達來介導免疫耐受。該遞藥系統(tǒng)中，SIGN核酸適配體能夠迅速誘導免疫耐受，內(nèi)化后的mTOR siRNA隨后抑制免疫應(yīng)答，microRNA能夠長時間促進HLA-G的表達來介導免疫耐受。由于不同的RNA在不同的時間點發(fā)揮作用，因此該遞藥系統(tǒng)能夠維持移植中長時間的免疫耐受。

雖然外泌體作為載體遞送核酸或小分子藥物具有安全、高效、循環(huán)時間長等優(yōu)勢，但是來源有限、產(chǎn)量低、獲取困難限制了其廣泛應(yīng)用。Pei等[20]通過擠壓的方法輕松獲得大量尺寸可控、生物均一性好的生物膜囊泡。在該生物膜囊泡上修飾AS1411核酸適配體可使該納米載體具有腫瘤靶向的能力。此外，通過孵育和膽固醇介導的方法可將阿霉素(doxorubicin, DOX)和P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)siRNA高效裝載到該生物膜囊泡上。其中P-gp是一種腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)驅(qū)動的泵，可將細胞內(nèi)的化療藥物轉(zhuǎn)運出細胞，是腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)的關(guān)鍵。結(jié)果顯示，該遞藥系統(tǒng)通過P-gp siRNA的基因沉默和DOX誘導的生長抑制成功克服了耐藥并協(xié)同殺傷了MDR腫瘤。這種基于紅細胞膜制成的納米囊泡遞藥系統(tǒng)為MDR腫瘤的協(xié)同靶向治療提供了新思路。

3.3 核酸適配體聯(lián)合球形多孔納米顆粒靶向遞送siRNA球形多孔納米是理想的藥物遞送納米結(jié)構(gòu)。介孔二氧化硅納米顆粒(mesoporous silica nanoparticles, MSNs)是一種比表面積大、孔隙大且孔徑可調(diào)的球形無機生物載體材料，其表面可以進行各種化學修飾?；谄涞图毎拘院透咻d藥能力，已被大量研究作為藥物和siRNA的傳遞平臺。Xie等[21]將DOX裝載到修飾有巰基的MSNs中，隨后將AS1411和siTIE2的巰基與MSNs的巰基共價連接構(gòu)建了具有靶向和氧化還原響應(yīng)的遞藥系統(tǒng)MSN-SS-siTIE2/Apt@DOX。在該遞藥系統(tǒng)中，AS1411賦予MSNs靶向腫瘤細胞的能力，siTIE2能夠抑制TIE2基因的表達從而抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移；與此同時，AS1411和siTIE2兩種核酸可作為“門控開關(guān)”調(diào)節(jié)MSNs中DOX的釋放，從而解決了DOX在體液循環(huán)中滲漏的問題。當MSN-SS-siTIE2/Apt@DOX被癌細胞攝取后，細胞內(nèi)高濃度的氧化還原分子，如谷胱甘肽會觸發(fā)siTIE2的釋放，隨即釋放DOX，從而抑制轉(zhuǎn)移性乳腺癌的遷移。

由于目前大部分球形多孔納米顆粒由不可降解的無機材料組成，阻礙了臨床應(yīng)用。Li等[22]以RNA為構(gòu)建塊，環(huán)糊精為黏合劑，通過滾環(huán)轉(zhuǎn)錄(rolling circle transcription, RCT)和獨特超分子介導的方法制備多孔RNA納米球。通過RCT生成的串聯(lián)、重復序列包含EpCAM核酸適配體和EpCAM siRNA。其中，多拷貝的EpCAM siRNA，解決了傳統(tǒng)載體siRNA裝載率低的問題。RCT產(chǎn)物上的環(huán)糊精能夠有效促進多孔納米結(jié)構(gòu)的形成，可裝載索拉非尼用于肝癌的治療。結(jié)果顯示，多孔納米球在核酸適配體的的幫助下特異性靶向并內(nèi)化到肝癌細胞中，然后被Dicer酶水解，釋放的siRNA和索拉非尼進行協(xié)同治療。其協(xié)同效應(yīng)已在體外功能實驗、皮下荷瘤小鼠和原位荷瘤小鼠模型中得到驗證?；诨蛑委熍c化療協(xié)同作用的廣闊前景，以及多孔納米球中RNA和環(huán)糊精可以分別裝載各種不同類型的siRNA和小分子藥物，這種形式的生物多孔納米球為靶向遞送特定腫瘤的藥物提供了廣闊的前景。

3.4 核酸適配體聯(lián)合RNA/DNA納米顆粒靶向遞送siRNA三聯(lián)節(jié)(three-way-junction, 3WJ)是源于噬菌體包裝RNA(packaging RNA, pRNA)中核心的一段，3個端點可分別連接靶向、治療、成像模塊[7]?；谄淞己玫臒崃W/化學穩(wěn)定性，常被用作傳遞siRNA等小分子的載體。Li等[23]利用2′氟修飾的3WJ作為納米材料的連接核心，在3WJ的兩端共價連接HER2核酸適配體和X-box結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)siRNA組裝成RNA納米粒子(8.54 ± 1.27 nm)。其中XBP1基因與HER2+乳腺癌化療敏感性與增殖有關(guān)。結(jié)果顯示，經(jīng)靜脈注射后，含HER2適配體的RNA納米粒子與腫瘤細胞有著較強的結(jié)合，而不與健康組織結(jié)合。并且能夠特異性敲除HER2+乳腺癌小鼠模型中XBP1基因，從而顯著抑制乳腺癌生長，并促進化療敏感性。

可編程DNA納米結(jié)構(gòu)是一類新型的生物相容性好、無毒的納米材料，可作為siRNA、蛋白的遞送載體，然而靶向能力不足和載藥效率較低限制了其廣泛使用。Qian等[24]以分步和自組裝的方式制作DNA納米柱來用于癌癥治療。一條核心DNA鏈(P1)與三條相同的外周PR鏈或PA鏈通過堿基配對相互作用形成三角形，兩個三角形進一步折疊并自組裝成一個棱鏡結(jié)構(gòu)。PR鏈帶有一段懸垂與Rab26 siRNA互補，PA鏈中含有靶向MUC-1核酸適配體序列。其中Rab26蛋白參與內(nèi)皮細胞凋亡和高通透性，可作為癌癥治療的潛在靶點；MUC1在許多癌癥細胞系中過表達。在該項設(shè)計中，Rab siRNA和MUC-1核酸適配體的數(shù)量和位置可以通過切換PA鏈或PR鏈來輕松調(diào)整。所有具有不同功能的納米棱柱都以高產(chǎn)率自組裝，其自組裝的產(chǎn)率用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和動態(tài)光散射技術(shù)得到了驗證。并且，DNA納米棱柱的細胞攝取與每個納米棱柱上的核酸適配體數(shù)量成正比?？偟膩碚f，所制備的DNA納米棱柱顯示出優(yōu)異的抗癌活性和靶向能力，可用于個性化的癌癥治療。

4 總結(jié)與展望

本綜述中總結(jié)了利用細胞特異性核酸適配體靶向遞送siRNA在設(shè)計和應(yīng)用方面最新進展。核酸適配體-siRNA嵌合體設(shè)計合成簡單，但在血液中快速清除、酶降解一直是其向臨床轉(zhuǎn)化的一大障礙。目前，研究者已進行了大量研究來探索改善核酸適配體-siRNA嵌合體的藥代動力學特性。采用PEG與核酸適配體結(jié)合能顯著增強核酸適配體-siRNA嵌合體的循環(huán)半衰期并增強酶穩(wěn)定性。此外，PEG的結(jié)合可以增加核酸適配體-siRNA嵌合體的生物利用度，并降低其體內(nèi)的免疫反應(yīng)；利用化學修飾，如2′-氟，2′-甲氧基等修飾核酸適配體骨架中核糖或脫氧核糖的2′位氫可以抵抗核酸酶。

利用核酸適配體-siRNA嵌合體靶向遞送siRNA時，siRNA活性的降低也是限制其廣泛應(yīng)用的一大問題。有研究表明[25]，siRNA的熱穩(wěn)定性是影響其基因沉默效率的一個重要參數(shù)。低熔點的siRNA與核酸適配體結(jié)合時，其活性不受影響或受影響最小。并且，當siRNA偶聯(lián)到2′-氟修飾核酸適配體的3′端時，siRNA的活性受影響最小。雖然化學修飾有助于增強siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性，但合理的化學修飾仍然是一個挑戰(zhàn)。找到每個核酸適配體-siRNA嵌合體的最優(yōu)化修飾，使其治療效果最大化至關(guān)重要。未來的研究方向可借助強大的計算算法來幫助選擇高度特異性的適配體-siRNA嵌合體的組成和化學修飾。

當siRNA被靶細胞或靶組織內(nèi)化后，不良的溶酶體逃逸仍然是限制其發(fā)揮基因沉默作用的主要原因。目前，研究者已采用了多種方法來增強siRNA的溶酶體逃逸。如應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”或pH響應(yīng)型脂質(zhì)體[17]可有效增強siRNA的溶酶體逃逸；通過脂質(zhì)體裝載魚精蛋白壓縮的siRNA從而增大siRNA的溶酶體逃逸量[16]。采用天然生物膜囊泡遞送siRNA也能夠?qū)崿F(xiàn)有效的溶酶體逃逸[19-20]。

由于有關(guān)核酸適配體的毒理學信息有限，其潛在的毒副作用及其作用機制尚未完全闡明。如高濃度的核酸可能引起一些潛在的毒性反應(yīng)，包括非特異性組織積累、非特異性免疫反應(yīng)等。未來應(yīng)對核酸適配體-siRNA嵌合體以及核酸適配體結(jié)合的納米載體的生物安全性進行評估，以便更好地向臨床轉(zhuǎn)化。總的來說，該綜述概述了核酸適配體靶向遞送siRNA在疾病治療中的設(shè)計策略及其應(yīng)用的最新研究進展。

(作者貢獻：呂子陽負責文章的文獻調(diào)研、起草、撰寫及修改；任歡歡負責校對全文；聶盛丹和王珊負責論文選題、指導及作批評性審閱。

利益沖突：該文所有作者均聲明不存在利益沖突。)