方 卉，楊俊發(fā)，姚 瑤，蔣 啟，路正東，王根寶

(1. 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院，浙江 杭州 310015；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，安徽 合肥 230032；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江 杭州 310006；4.安徽醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在惡性腫瘤中的發(fā)病率和致死率排全球前五[1]。在中國，因腫瘤死亡的患者大多數(shù)由肝癌導(dǎo)致的[2]。目前，初期診療、手術(shù)和介入診療、靶向藥物治療已經(jīng)成熟應(yīng)用于臨床上肝癌的治療，但是每年仍有幾十萬人因肝癌死亡[3]；表明肝癌的初期診斷和治療迫在眉睫[4]，因此進(jìn)一步了解其發(fā)生機(jī)制可能有助于肝癌的治療。MicroRNA (miRNA)是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過結(jié)合目標(biāo)信使RNA (mRNA)的3 '非翻譯區(qū)域(UTR)負(fù)調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯的RNA。哺乳動(dòng)物miRNA參與了多種生物學(xué)過程，如分化、增殖、抗氧化應(yīng)激和腫瘤抑制[5]。更重要的是，最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-124在多種腫瘤中表達(dá)降低，例如肝癌、乳腺癌等，并且其參與了許多生物學(xué)過程，例如遷移、增殖、周期、凋亡和自噬等過程，表明miR-124與腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[6-7]。E盒結(jié)合鋅指蛋白2(ZEB2)屬于E盒結(jié)合鋅指蛋白基因家族。有研究發(fā)現(xiàn)，ZEB2可以調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)，間接調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)程，包括非小型細(xì)胞癌，肺癌和肝癌[8]。本研究旨在明確miR-124與ZEB2的靶向關(guān)系，探討miR-124對肝癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的影響，為治療HCC提出新的診斷標(biāo)志物和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器，試劑和細(xì)胞系肝癌細(xì)胞株HepG2和正常肝細(xì)胞株L-02(安徽醫(yī)科大學(xué))；雙熒光素酶試劑盒(美國Promega公司)；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒(上海BestBio生物公司)、ZEB2，MMP2，MMP9和PCNA抗體(中國武漢proteinech公司)、顯影液(美國Millipo公司)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板(中國Nest生物公司)、Transwell小室(美國Thermo Fisher公司)、LippfectamineTM200(美國英杰公司)、TRIzol Reagent RNA 提取試劑(美國Sigma公司)、PVDF膜(德國MERCK公司)、脫脂牛奶(上海光明公司)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(中國BI公司)、miR-124 mimics，miR-124 inhibitor，ZEB2 siRNA，ZEB2質(zhì)粒(上海GenePharma公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)在高糖培養(yǎng)基(10% FBS)中復(fù)蘇凍存細(xì)胞，培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞孵育箱中；當(dāng)密度高于90%時(shí)，消化細(xì)胞并傳代，后續(xù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行處理。

1.3 臨床樣本獲取收集6例HCC患者的肝癌組織和癌旁組織，癌旁組織為正常對照肝組織。 所有樣本采集自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，所有患者均知情同意，得到安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞被分為空白組，陰性對照組(miR-124 NC、ZEB2-NC和Vector)，miR-124 inhibitor組，miR-124 mimics組，ZEB2-siRNA組，ZEB2質(zhì)粒組(ZEB2-OE)。采用LipfeetamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后，進(jìn)行換液，24 h或者48 h后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求處理已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

1.5 qRT-PCR首先對用TRIzol法提取的RNA濃度進(jìn)行測定，然后根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并按照SYBR Premix Ex TaqⅡ加樣體系，再對所得的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。在CFX96實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀進(jìn)行檢測。采用U6/GAPDH反應(yīng)后采用2-ΔΔCt法計(jì)算RNA的量，各基因引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primers involved in qRT-PCR

1.6 細(xì)胞周期檢測轉(zhuǎn)染48 h后，用冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌收集的樣本細(xì)胞(1×106～5×106)兩次，并在預(yù)冷的70%～75%冰凍乙醇固定。隨后，用冷PBS洗滌細(xì)胞1次。用200～500 μL冷PBS重懸細(xì)胞。加入RNase A 溶液20 μL 37 ℃水浴30 min。加入 400 μL PI染液溶液，緩慢混合后在4 ℃避光孵育30～60 min。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化。激發(fā)波長為488 nm。使用合適的分析軟件進(jìn)行分析。

1.7 細(xì)胞侵襲能力檢測將1×104個(gè)細(xì)胞接種到無血清的高糖培養(yǎng)基的Transwell小室上層。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，上層聚碳酸酯膜上接種上Matrigel 基底膠。將600 μL含10%血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液加入下層。培養(yǎng)24 ～48 h后，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，并且顯微鏡下計(jì)數(shù)跨膜細(xì)胞。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞鋪至6孔板中，轉(zhuǎn)染結(jié)束后，用無菌的黃色槍頭在6孔板的中央輕輕劃痕，劃痕后，用PBS清洗，然后加入無血清的高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后，在顯微鏡下觀察并拍照，劃痕愈合率越高表明細(xì)胞遷移能力越高。

1.9 CCK-8將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種到96孔板中，培養(yǎng)基體積為100 μL。在培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后，向每孔內(nèi)加入10 μL CCK-8反應(yīng)溶液。4 h后，采用酶標(biāo)儀檢測每孔吸光度(450 nm)。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)利用生物信息學(xué)的預(yù)測軟件對miR-124的靶基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，ZEB2可能是miR-124的靶基因。根據(jù)預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)，ZEB2野生型(ZEB2-WT)和突變型(ZEB2-MUT)熒光素酶質(zhì)粒購買于湖南長沙贏潤生物；采用LipfeetamineTM2000 將ZEB2-WT、ZEB2-MUT和miR-124 mimics轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中，24 h后，使用 Dual Luciferase 試劑盒檢測各組熒光強(qiáng)度。

1.11 Western blot轉(zhuǎn)染24 h后，將收集的細(xì)胞進(jìn)行充分裂解(RIPA裂解液)，提總蛋白；用Pierce BCA Protein檢測蛋白濃度；然后通過SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(GE Healthcare Life Science)。用5%脫脂牛奶阻斷膜1 h，用各自的一抗過夜，用二抗(小鼠或兔)孵育1 h，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。用ImageJ軟件定量分析曝光結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參。計(jì)算ZEB2、PCNA、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 miR-124和ZEB2在肝癌細(xì)胞系HepG2中的表達(dá)水平采用qRT-PCR檢測miR-124在人肝癌細(xì)胞系HepG2和人正常肝細(xì)胞系L-02中的表達(dá)，結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞中miR-124水平相比于L-02細(xì)胞明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IHC和Western blot檢測ZEB2的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，ZEB2在肝癌組織和HepG2細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這些數(shù)據(jù)表明miR-124在肝癌細(xì)胞中地表達(dá)，ZEB2在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，且miR-124與ZEB2呈負(fù)相關(guān)，見Fig 1。

2.2 miR-124對HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響CCK-8的結(jié)果顯示，與miR-124 NC組相比，HepG2細(xì)胞的增殖活性因miR-124 mimics明顯被抑制；而miR-124 inhibitor明顯促進(jìn)了HepG2細(xì)胞的增殖活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，通過流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果可以看到，S+G2/M期的細(xì)胞比例因miR-124 mimics明顯降低(P<0.05)。Western blot檢測PCNA蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與miR-124 NC組相比，HepG2細(xì)胞中PCNA蛋白的表達(dá)因miR-124 mimics明顯被抑制；而HepG2細(xì)胞中PCNA蛋白的表達(dá)因miR-124 inhibitor明顯被促進(jìn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，過表達(dá)miR-124明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖活性，沉默miR-124明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖活性，見Fig 2。

2.3 miR-124對HepG2細(xì)胞侵襲和遷移的影響Transwell檢測轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和miR-124 inhibitor的HepG2細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示，與miR-124 NC組比較，miR-124 mimics組的細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯降低；而miR-124 inhibitor組細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力；結(jié)果顯示，與miR-124 NC組相比，在miR-124 mimics組劃痕的愈合率明顯降低，而miR-124 inhibitor組的劃痕愈合明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot檢測MMP2和MMP9蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與miR-124 NC組相比，miR-124 mimics明顯抑制MMP2和MMP9蛋白表達(dá)；而miR-124 inhibitor明顯增加MMP2和MMP蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，過表達(dá)miR-124明顯抑制HepG2細(xì)胞侵襲和遷移能力，沉默miR-124明顯提高HepG2細(xì)胞侵襲和遷移能力，見Fig 3。

Fig 1 Expression of miR-124 and ZEB2

2.4 miR-124與ZEB2的靶向關(guān)系根據(jù)靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-124的靶基因，結(jié)果顯示ZEB2可能是miR-124的靶基因，ZEB2 3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)或突變位點(diǎn)序列，見Fig 4A。為了從功能上證明這一點(diǎn)，我們用ZEB2 3′-UTR熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，結(jié)果表明，共轉(zhuǎn)染miR-124 NC和ZEB2-3′-UTR組細(xì)胞中熒光素酶活性為(10.30±0.61)，共轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和ZEB2-3′-UTR組細(xì)胞熒光活性為(2.459±0.38)，低于共轉(zhuǎn)染miR-124 NC和ZEB2-3′-UTR組(P<0.05)；共轉(zhuǎn)染miR-124 NC和ZEB2-MUT組細(xì)胞中熒光素酶活性為(11.13±0.48)，共轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和ZEB2-MUT組細(xì)胞熒光活性為(10.85±0.93)，與共轉(zhuǎn)染miR-124 NC和ZEB2-WT組比較無差異，見Fig 4B；轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和miR-124 inhibitor后用qRT-PCR和Western blot檢測ZEB2蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與miR-124 NC組相比，miR-124 mimics組ZEB2表達(dá)水平明顯降低；相反miR-124 inhibitor組表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 4C和4D。因此，ZEB2是miR-124的有一個(gè)潛在靶點(diǎn)，證實(shí)了mi-124與ZEB2的靶向關(guān)系。

Fig 3 Effect of miR-124 on HepG2 invasion and migration n=3)

Fig 4 ZEB2 is a functional target of miR-124 n=3)

2.5 ZEB2對HepG2細(xì)胞增殖的影響CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)檢測將ZEB2-siRNA和ZEB2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入HepG2細(xì)胞后細(xì)胞的增殖活性。CCK-8結(jié)果顯示，與對照組相比，ZEB2-siRNA明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖活性，而ZEB2質(zhì)粒明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，ZEB2-siRNA明顯降低S+G2/M期細(xì)胞比例，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot檢測PCNA蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，ZEB2-siRNA明顯抑制PCNA蛋白表達(dá)；而ZEB2質(zhì)粒明顯促進(jìn)PCNA蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，沉默ZEB2明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖活性，過表達(dá)ZEB2明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖活性，見Fig 5。

Fig 5 Effect of ZEB2 on HepG2 proliferation and apoptosis n=3)

Fig 6 Effect of ZEB2 on HepG2 invasion and migration n=3)

2.6 ZEB2對HepG2細(xì)胞侵襲和遷移的影響結(jié)果顯示，與對照組相比，ZEB2-siRNA組細(xì)胞數(shù)量明顯降低；而ZEB2質(zhì)粒組細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力，結(jié)果顯示，與對照組相比，ZEB2-siRNA組的劃痕愈合率明顯降低，相反ZEB2質(zhì)粒組中明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot檢測細(xì)胞中MMP2和MMP9蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，ZEB2-siRNA明顯抑制MMP2和MMP蛋白表達(dá)；而ZEB2質(zhì)粒明顯促進(jìn)MMP2和MMP蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，沉默ZEB2明顯抑制HepG2細(xì)胞侵襲和遷移能力，過表達(dá)ZEB2明顯提高HepG2細(xì)胞侵襲和遷移能力，見Fig 6。

3 討論

肝癌是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌，屬于惡性腫瘤。目前一線的治療方法是手術(shù)切除和肝臟移植，但由于肝癌具有較高的轉(zhuǎn)移性和耐藥性導(dǎo)致預(yù)后較差，降低肝癌患者的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)迫在眉睫。因此，需要進(jìn)一步闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制，從而找到更多有效的診斷和治療方法[9]。miRNAs是一類高度保守的組織特異性非蛋白編碼小RNA，通過負(fù)性基因調(diào)控維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。適當(dāng)控制miRNA的表達(dá)是一個(gè)平衡的生理環(huán)境所必需的。越來越多的研究表明，miRNA在人類疾病中起著關(guān)鍵作用[10-11]。此外，多項(xiàng)研究表明，miRNA表達(dá)的反常通過充當(dāng)腫瘤抑制因子和致癌基因與各種癌癥密切相關(guān)，間接調(diào)控癌癥的進(jìn)程，例如生長、凋亡、遷移和侵襲等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-124表達(dá)水平在肝癌中明顯降低，并且HepG2的遷移和侵襲能力，增殖能力明顯被miR-124 mimics抑制，其惡性程度也會(huì)隨之降低。Chen等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-124表達(dá)在肝癌組織中減少，并且水通道蛋白3的表達(dá)可明顯被miR-124 mimics抑制，進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖及遷移能力的降低。有趣的是，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與Chen發(fā)現(xiàn)的一致。此外，之前的研究也發(fā)現(xiàn)，SMMC-7721細(xì)胞和BEL-7404細(xì)胞的遷移和侵襲能力可以被miR-124抑制[14]。這些結(jié)果表明，miR-124是了解和治療肝癌發(fā)病機(jī)制的一個(gè)新的診斷和治療靶點(diǎn)。

EMT是上皮細(xì)胞失去頂基極性和細(xì)胞間黏附，向侵襲性間充質(zhì)細(xì)胞過渡的過程。EMT涉及許多生物學(xué)和病理過程，包括胚胎發(fā)育、傷口愈合、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和耐藥性。MiRNA 主要通過和下游靶基因的3′-UTR結(jié)合，進(jìn)而抑制靶基因的表達(dá)，從而影響惡性腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和EMT。ZEB2作為EMT激活分子，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的主要驅(qū)動(dòng)因素。研究表明，ZEB2和乳腺癌、肺腺癌、大腸癌等惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)在HepG2細(xì)胞中ZEB2對HepG2細(xì)胞凋亡、增殖、遷移，侵襲和EMT的作用及miR-124對ZEB1的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制ZEB2表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和增殖，ZEB2通過調(diào)控E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞克隆的形成、遷移和侵襲。為更進(jìn)一步探究上游調(diào)控的miRNA，我們通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)ZEB2是miR-124的潛在靶點(diǎn)。因此，我們選擇miR-124作為我們的研究對象。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-124通過靶向于ZEB2進(jìn)而抑制EMT和誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡來抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。本實(shí)驗(yàn)中，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和Western blot結(jié)果證實(shí)了miR-124可靶向作用于ZEB2進(jìn)而抑制ZEB1表達(dá)。首次闡明了miR-124通過與ZEB2的3′-UTR相互作用，調(diào)控肝癌的增殖、凋亡、遷移，侵襲和EMT。

綜上，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證明，miR-124促進(jìn)HCC細(xì)胞的凋亡和抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，推測其通過下調(diào)ZEB2表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生而抑制HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移，為HCC轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入研究及臨床治療提供新的潛在靶點(diǎn)。