劉 磊，嚴思晴，丘甜美，何援利，徐嘉文，蔡慧華，何善陽

[1.廣東省心血管病研究所，廣州 510080;2.廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學科學院)婦產科，廣州 510080;3.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院婦產科，廣州 510280]

宮腔粘連(intrauterine adhesions,IUA)是子宮內膜損傷后修復障礙所致的宮腔部分或全部閉塞，常伴月經過少、閉經、不孕、復發(fā)性流產等生殖問題[1]。在我國，IUA發(fā)病率居高不下，在繼發(fā)性不孕癥中占27.5%～61.5%，在胚胎移植失敗中占24.2%～29.1%[2,3]。宮腔鏡下宮腔粘連分離術及術后眾多的輔助方案能改善IUA患者的宮腔形態(tài)，甚至增加或恢復部分患者的月經量，但術后粘連復發(fā)和后續(xù)的不孕問題使得IUA治療仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。研究顯示,IUA患者術后復發(fā)率高達30%～66%[4]，而總的妊娠率僅為42.8%～66.1%[4]。因此，積極尋求有效的IUA治療方法，尤其是針對其發(fā)病機制的靶向治療，已成為臨床上亟待解決的難題。

目前IUA的發(fā)病機制尚未完全明確。最早于1978年有學者發(fā)現(xiàn),IUA的病理特征為子宮壁纖維組織異常增多[5]。之后陸續(xù)有越來越多的研究包括本課題組前期工作，證實IUA本質上是子宮內膜纖維化[6-8]。迄今，已有報道小分子代謝物質及其相關通路的變化參與了其他臟器纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展[9-11]，但基于子宮內膜樣本的代謝組學分析IUA或子宮內膜纖維化的相關研究則鮮有報道。本研究旨在通過非靶向代謝組學方法探索IUA的潛在標志物，為IUA的發(fā)病機制及診治策略提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年7月至2019年4月在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院確診為IUA并行宮腔鏡宮腔粘連分離術的患者74例(IUA組)。選取同期行宮腔鏡檢查或宮腹腔鏡聯(lián)合檢查且病理確診子宮內膜無病變的育齡女性患者27例(對照組)。排除標準：(1)病理證實為有子宮內膜組織學改變，如子宮內膜息肉、子宮黏膜下肌瘤、子宮內膜不典型增生、子宮內膜癌；(2)有手術及激素治療禁忌證，如凝血功能障礙、急性生殖道感染、嚴重肝腎功能損傷。研究對象均知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 甲醇(CAS 67-56-1，LC-MS級，CNW Technologies)、乙腈(CAS 75-05-8，LC-MS級，CNW Technologies)、乙酸銨(CAS 631-61-8，LC-MS級，SIGMA-ALDRICH)、氨水(CAS 1336-21-6，LC-MS級，F(xiàn)isher Chemical)、超純水(屈臣氏)、超高效液相儀(型號Vanquish,Thermo Fisher Scientific)、高分辨質譜儀(型號Q Exactive HFX,Thermo Fisher Scientific)、離心機(型號Heraeus Fresco17,Thermo Fisher Scientific)、天平(型號BSA124S-CW,Sartorius)、研磨儀(型號JXFSTPRP-24,上海凈信科技有限公司)、超聲儀(型號PS-60AL,上深圳市雷德邦電子有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 患者在全身麻醉后接受宮腔鏡手術，操作過程中宮腔電切鏡外鞘避免接觸陰道壁，用環(huán)狀電切環(huán)在不帶電狀態(tài)下輕輕刮取少許內膜組織，將其放在無菌無酶凍存管后迅速投放到液氮罐中儲存。

1.3.2 代謝物提取 稱取2mg樣品，加500μL提取液(甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1(V/V)，含同位素標記內標混合物)；35Hz研磨處理4min，超聲5min(冰水浴)；重復3次；-40℃靜置1h；將樣品4℃，12000r/min離心15min；取上清于進樣瓶中上機檢測；所有樣品另取等量上清混合成質量控制樣品上機檢測。

1.3.3 上機檢測 使用Vanquish超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1mm×100mm,1.7μm)液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離。液相色譜A相為水相，含25mmol/L乙酸銨和25mmol/L氨水，B相為乙腈。樣品盤溫度4℃，進樣體積3μL。Thermo Q Exactive HFX質譜儀能在控制軟件(Xcalibur，Thermo)控制下進行一級、二級質譜數(shù)據(jù)采集。詳細參數(shù)：Sheath gas flow rate:30 Arb,Aux gas flow rate:25 Arb,Capillarytemperature:350℃,Full ms resolution:60000,MS/MS resolution:7500,Collision energy:10/30/60 in NCE mode,Spray Voltage:3.6kV (positive)或-3.2kV (negative)。

1.4 數(shù)據(jù)處理 原始數(shù)據(jù)經ProteoWizard軟件轉成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包(內核為XCMS)進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理，然后與BiotreeDB(V2.1)自建二級質譜數(shù)據(jù)庫匹配進行物質注釋，算法打分的Cut off值設為0.3。應用正交偏最小二乘判別分析進行建模，并結合單變量和多元變量分析篩選差異代謝物。KEGG注釋分析差異代謝物參與的通路，通過富集分析和拓撲分析，篩選出與代謝物差異相關性最高的關鍵通路。R語言繪制受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve,ROC)。

2 結 果

2.1 模式識別與差異代謝物分析 正離子模式下，OPLS-DA得分圖(圖1A)顯示：IUA組與對照組分離明顯，該模型R2Y=0.594，Q2=0.183；進一步對該模型進行置換檢驗(圖1B)，R2在Y軸的截距為0.500，Q2在Y軸的截距為-0.530，其值小于0。表明該模型不存在過擬合現(xiàn)象，可據(jù)此進行差異代謝物的篩選。101個子宮內膜樣本中共檢測出8197個peak，通過與HMDB數(shù)據(jù)庫匹配，其中633種代謝物被成功鑒定出來。進一步結合單變量及多元變量統(tǒng)計分析，結果顯示，其中87種代謝物在IUA患者中呈差異表達。這些差異代謝物包括27種脂質和類脂質分子,24種有機酸及其衍生物,12種有機雜環(huán)化合物,8種有機氧化合物,5種生物堿及其衍生物,4種有機含氮化合物,3種苯環(huán)型化合物,1種核苷、核苷酸和類似物,1種有機氮化合物,1種有機硫化合物,1種其它。

圖1 正離子模式下IUA患者及正常子宮內膜女性的子宮內膜代謝譜A：OPLS-DA得分散點圖；B：置換檢驗圖

負離子模式下，OPLS-DA得分圖(圖2A)顯示：IUA組與對照組分離明顯，該模型R2Y=0.694，Q2=0.235；進一步對該模型進行置換檢驗(圖2B)，R2在Y軸的截距為0.460，Q2在Y軸的截距為-0.580，其值小于0。表明該模型不存在過擬合現(xiàn)象，可據(jù)此進行差異代謝物的篩選。101個子宮內膜樣本中共檢測出6275個peak，通過與HMDB數(shù)據(jù)庫匹配，其中250種代謝物被成功鑒定出來。進一步結合單變量及多元變量統(tǒng)計分析，結果顯示，其中39種代謝物在IUA患者中呈差異表達。這些差異代謝物包括12種脂質和類脂質分子,12種有機酸及其衍生物,4種核苷、核苷酸和類似物,4種有機氧化合物,3種苯環(huán)型化合物,3種有機雜環(huán)化合物,1種苯丙烷和聚酮化合物。

綜上，由于兩組間的肌酸酐水平在正、負離子模式均存在差異，即正、負離子模式的差異代謝物存在1種重復代謝物，因此總離子模式共有125種差異代謝物。設定多元變量統(tǒng)計分析參數(shù)P<0.01，VIP(差異貢獻值)>1且FC(倍數(shù)變化IUA vs Control)>3或<0.33，最終篩選出10種具有潛在生物標志物作用的差異代謝物。與對照組相比，IUA組子宮內膜的3-甲基戊二酰肉堿(3-Methylglutarylcarnitine,3-MGC)、氟硅唑、L-辛酰肉堿、二甲基二烷基氯化銨、癸酰肉堿、賴氨酰-羥脯氨酸、二氫-2,4,6-三(2-甲基丙基)-4h-1,3,5-二噻嗪、L-己酰肉堿、丙酰肉堿(propionylcarnitine,PC)以及鄰苯二甲酸二丁酯均表達上調(表1)。

2.2 差異代謝通路分析 正離子模式下，IUA組與對照組在組氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，β-丙氨酸代謝，谷胱甘肽代謝，氮代謝，D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝，亞油酸，氰基氨基酸代謝，氨酰tRNA生物合成，泛酸和輔酶A生物合成，賴氨酸生物合成，丁酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，色氨酸代謝，氨基糖和核苷酸糖代謝，嘌呤代謝，卟啉與葉綠素代謝等21條代謝通路途徑差異有統(tǒng)計學意義(表2)。

負離子模式下，IUA組與對照組在嘧啶代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，丙酸代謝，苯丙氨酸代謝，檸檬酸循環(huán)，精氨酸和脯氨酸代謝，嘌呤代謝，β-丙氨酸代謝，戊糖磷酸途徑，谷胱甘肽代謝，丁酸代謝，煙酸和煙酰胺代謝，脂肪酸生物合成，乙醛酸和二羧酸代謝，淀粉和蔗糖代謝，酪氨酸代謝，類固醇激素生物合成等17條代謝途徑差異有統(tǒng)計學意義(表2)。

經富集分析，10種潛在生物標志物的差異代謝物均未找到上述相應的代謝通路?？紤]我們分析通路使用的數(shù)據(jù)庫是KEGG數(shù)據(jù)庫(目前國際上通路信息最大的數(shù)據(jù)庫)，若這個數(shù)據(jù)庫沒有收錄這些物質的通路信息，則做不了通路分析；但并不代表這個物質不存在或者沒有功能。鑒于KEGG數(shù)據(jù)庫的更新可能有滯后，所以下一步需要結合文獻檢索來分析這10種潛在生物標志物的差異代謝物的相關信號通路和功能。

表2 IUA患者與正常子宮內膜女性的子宮內膜差異代謝通路

2.3 ROC診斷模型的建立 10種潛在生物標志物的差異代謝物中，有4種物質用于診斷IUA的曲線下面積(area under the cure，AUC)>0.70，分別為賴氨酰羥脯氨酸(AUC=0.793)、丙酰肉堿(AUC=0.789)、氟硅唑(AUC=0.731)、3-MGC(AUC=0.743)。其中，賴氨酰-羥脯氨酸、PC聯(lián)合3-MGC或氟硅唑診斷IUA可達到最大效能，AUC均高達0.846(表3)。

3 討 論

IUA作為纖維化病變，其主要病理基礎是細胞外基質(extracellular matrix,ECM)合成與降解的動態(tài)失衡，促使ECM過度沉積[12]。ECM蓄積過程中必然伴隨著代謝物質及其相關通路的變化[13]。現(xiàn)階段能對機體分泌的代謝物進行整體性分析的技術被稱為代謝組學。其中，非靶向代謝組學主要是尋找差異代謝物，解釋差異代謝物在其參與的代謝通路中所執(zhí)行的生物學功能，從而為疾病的診斷和機制研究提供參考。近年來，子宮內膜組織基于代謝組學的生物標志物和機制研究的探索主要集中在子宮內膜癌、子宮內膜異位癥及不孕癥患者的子宮內膜容受性方面[14-16]，其在IUA的應用尚處于空白階段。本研究首次通過101例IUA患者和正常女性的子宮內膜非靶向代謝組學分析，成功篩選得到10種差異代謝物和38條差異代謝途徑。其中，IUA患者子宮內膜的3-MGC、氟硅唑、L-辛酰肉堿、二甲基二烷基氯化銨、癸酰肉堿、賴氨酰-羥脯氨酸、二氫-2,4,6-三(2-甲基丙基)-4h-1,3,5-二噻嗪、L-己酰肉堿、PC以及鄰苯二甲酸二丁酯水平較正常子宮內膜女性明顯上升。并且，經ROC曲線分析建立聯(lián)合診斷模型，認為3-MGC或氟硅唑聯(lián)合賴氨酰-羥脯氨酸和PC的診斷效能最佳，有望作為IUA的診斷標志物，有望為IUA的診治策略和機制研究提供新方向。

3-MGC作為脂肪?；鈮A之一，主要參與脂肪酸的β-氧化。首先，脂肪酸氧化是指油脂在充足的氧氣供應條件下水解產生的甘油和脂肪酸，進而產生二氧化碳和水，釋放出大量能量供身體使用。而脂肪酸的β-氧化是脂肪酸氧化的常見形式之一。在脂肪酸β-氧化過程中，第一步是脂肪酸被細胞液中的乙酰輔酶A激活為脂肪酸酰輔酶A。之后脂肪酰輔酶A被肉堿運輸?shù)骄€粒體中，進行β氧化，最終產生乙?；o酶A和脂肪?；鈮A[17-18]。有研究報道，脂肪?；鈮A在心肌中的積累可抑制脂肪酸的氧化，并產生一些有害作用[19]。隨后有研究證實，急性冠脈綜合征患者存在脂肪代謝紊亂，其中尿液3-MGC為主的脂肪?；鈮A水平明顯升高，有助于提高疾病的診斷效率和準確率[20]。眾所周知，急性冠脈綜合征是以冠脈粥樣硬化斑塊破裂或侵襲，繼發(fā)閉塞性血栓形成為病理基礎的臨床綜合征，可繼發(fā)心室重構和心肌間質纖維化[21]。除了心肌纖維化，在肝纖維化方面，Mann等[22]在多中心隊列人群中發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪肝相關的肝纖維化患者外周血1449種代謝物中，高水平的3-MGC與多種等位基因變異的個體風險相關，其中攜帶PNPLA3和HSD17B13等位基因的風險增加，而攜帶HSD17B13的風險減少。以上研究高度提示高水平3-MGC與纖維化疾病的發(fā)生相關。本研究亦發(fā)現(xiàn)，IUA患者子宮內膜組織中3-MGC蓄積，可能參與子宮內膜纖維化形成，后續(xù)需驗證其具體關系和機制。

氟硅唑是一種三唑類殺菌劑，主要通過破壞和阻止麥角甾醇的生物合成限制細胞膜的形成，最終引發(fā)病菌死亡，因此被廣泛應用于防治各種農作物的真菌感染[23]。然而，氟硅唑在人類健康和疾病方面的研究頗少。僅Karacaoglu等[24]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，氟硅唑可引起男性生育能力低下，其作用機制與細胞毒性、氧化應激受損、脂質代謝失調有關。氟硅唑在人體纖維化疾病或子宮內膜方面的研究，國內外尚無報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)，IUA子宮內膜纖維化患者中氟硅唑呈上升趨勢，且差異貢獻值和診斷IUA的效能一致，僅次于3-MGC。后續(xù)可通過體外研究其對子宮內膜間質細胞的細胞毒性、氧化應激及脂質代謝情況揭示其可能機制。

PC屬于?；鈮A，是肉堿與氨基酸或脂肪酸代謝物結合的一類酯類物質。其主要參與細胞內的能量代謝，尤其是線粒體內脂肪酸的β-氧化過程，在間歇性跛行、心血管疾病、糖尿病等方面均有相關報道[25-27]。Silvestro等[25]報道，在間歇性跛行患者中，踏車運動可引起急性內皮功能惡化和血漿黏附分子濃度增加，而靜脈注射PC可有效預防這些損害。Broderick等[26]發(fā)現(xiàn)，PC可通過影響線粒體的丙酮酸代謝改善糖尿病和缺血性心臟病大鼠的心臟代謝和功能。李蕾等[27]則檢測到2型糖尿病大鼠血清PC高表達，通過運動干預3個時間點均能有效下調PC和血糖水平。提示PC在不同疾病或疾病的不同階段存在差異，并非絕對起保護作用。本研究亦發(fā)現(xiàn)，IUA患者子宮內膜組織中PC高表達，可能參與子宮內膜纖維化的發(fā)生。迄今，PC在其他臟器纖維化疾病中的表達鮮有報道，因此仍需擴大子宮內膜臨床樣本量及分層分析進行驗證其在組織纖維化中的作用。賴氨酰-羥脯氨酸是在IUA患者中具有潛在診斷標志物的代謝物，目前尚無文獻報道，有待進一步驗證。

綜上所述，IUA患者表現(xiàn)出有別于正常女性的子宮內膜代謝譜特征。本研究篩選得到的4種差異代謝物組合，即3-MGC或氟硅唑聯(lián)合賴氨酰-羥脯氨酸和PC，有望作為診斷IUA的潛在標志物，后續(xù)仍需擴大樣本量及開展臨床前實驗進行驗證。