李小芳，胡 克，李潔明，金文艷，陳秋平，周香城，張小偉，周嘉禾，鐘明琳，李 荔

(1.廣東省婦幼保健院婦科，廣州 510000；2.廣東省婦幼保健院婦女兒童健康研究所，廣州 510000；3.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣州 510000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期婦女一種常見的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。PCOS患者因稀發(fā)排卵或閉經(jīng)使子宮內(nèi)膜長期處于增殖狀態(tài)，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生病變甚至癌變。PCOS導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生相關(guān)病變的具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚，危險因素尚不明確。深入研究PCOS子宮內(nèi)膜增生病變的相關(guān)危險因素是近年來的臨床研究熱點。早期研究者多關(guān)注于相關(guān)蛋白分子機(jī)制水平，在已發(fā)現(xiàn)的幾個蛋白或基因中進(jìn)行分析，從而驗證出對疾病發(fā)生發(fā)展可能具有重要意義的蛋白質(zhì)或基因，繼而試圖尋找重要治療靶點及深入其功能水平的研究。但蛋白質(zhì)水平研究往往是片面性、單方面及多通路的，難以從根源上反映子宮內(nèi)膜病變的變化機(jī)制。子宮內(nèi)膜是一種快速循環(huán)增長、分化及凋亡過程的獨特組織。在PCOS患者中，異常的激素環(huán)境及代謝失衡可調(diào)控子宮內(nèi)膜基因表達(dá)來改變子宮內(nèi)膜的穩(wěn)態(tài)，尤其可促進(jìn)有缺陷的腺體和細(xì)胞增殖。隨著人類基因組測序的發(fā)展，越來越多的動植物、微生物基因組序列得以測定，基因序列數(shù)據(jù)迅速增長。本研究期望從全基因水平上深入探討PCOS患者發(fā)生子宮內(nèi)膜增生病變的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年3月～2019年11月于廣東省婦幼保健院行宮腔鏡檢查+診刮術(shù)的111例PCOS患者。根據(jù)子宮內(nèi)膜病理檢查結(jié)果將患者分為子宮內(nèi)膜病變組(polycystic ovary syndrome with endometrial lesions，PCOS-EH)(37例，包括子宮內(nèi)膜息肉及息肉樣增生、子宮內(nèi)膜單純性增生、子宮內(nèi)膜復(fù)雜性增生、子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)膜癌)和子宮內(nèi)膜正常組(polycystic ovary syndrome with nomal endometrium，PCOS-E)(74例，包括增殖期、分泌期)。PCOS-EH組和PCOS-E組各隨機(jī)選取10例，PCOS-EH組包括子宮內(nèi)膜單純性增生1例、子宮內(nèi)膜復(fù)雜性增生5例、子宮內(nèi)膜不典型增生3例、子宮內(nèi)膜癌1例，PCOS-E均為正常增殖期子宮內(nèi)膜。診刮取出新鮮子宮內(nèi)膜組織，裝入1.5mL的無RNase(RNA酶)的離心管，管內(nèi)有1mL RNA保存液，-20℃冰箱保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2003年鹿特丹PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；(2)月經(jīng)初潮后3年且年齡18～40歲；(3)PCOS患者因不孕、異常子宮出血、超聲發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜回聲異?；蜃訉m內(nèi)膜增厚(>14mm)行宮腔鏡檢查+診刮術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)絕經(jīng)期PCOS，有吸煙史；(2)近6個月使用過調(diào)節(jié)血糖血脂、激素類或避孕藥物；(3)合并慢性基礎(chǔ)疾病、急慢性感染、自身免疫性疾病及惡性腫瘤患者；(4)宮腔鏡下發(fā)現(xiàn)宮腔粘連、黏膜下子宮肌瘤或其他子宮腫瘤患者；(5)宮腔鏡手術(shù)禁忌證患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意，患者知情同意并均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因表達(dá)譜的實驗流程 基因芯片購自上海安捷倫科技有限公司，名稱為G4102A，所用芯片規(guī)格SurePrint G3 Custom GE 8x60K，AMADID:071342。用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳評價RNA質(zhì)量，合格的RNA樣品進(jìn)行下一步測序。合成cDNA第一鏈，使用吸附柱(Spin Columns RS)純化cRNA，并使用NanoDrop ND-1000紫外分光光度計定量cRNA，雜交、組裝并洗滌芯片。

1.2.2 數(shù)據(jù)掃描及提取 Cy3標(biāo)記的樣品用Green光掃描，Cy5標(biāo)記的樣品用Red光掃描，雙通道標(biāo)記的樣品用Green+Red掃描。Agilent掃描儀所得圖像為兩種熒光的復(fù)合圖，經(jīng)Split-tiff軟件分割成單色熒光圖像，使用Agilent Feature Extraction Software提取數(shù)據(jù)，將圖像導(dǎo)入圖像分析軟件。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 使用GeneSpring GX軟件對基因微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，顯著差異基因表達(dá)篩選標(biāo)準(zhǔn)為兩個樣品信號強(qiáng)度間的比值(ratio值)>2或<0.5(根據(jù)95%的可信區(qū)間定義)。即認(rèn)為ratio值在2～0.5范圍內(nèi)的基因不存在顯著表達(dá)差異，而ratio值>2表明該基因在PCOS子宮增生內(nèi)膜中表達(dá)顯著上調(diào)，ratio值<0.5表明該基因在PCOS子宮增生內(nèi)膜中表達(dá)顯著下調(diào)。利用SAM軟件，篩選標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)>2.5及假陽性率設(shè)置(q-value)<5%作為差異表達(dá)基因。

1.2.4 差異表達(dá)基因的GO注釋和KEGG富集分析 將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋和KEGG信號通路富集分析，P<0.5為顯著性富集，統(tǒng)計各個term或Pathway中的差異基因數(shù)目。通過GO注釋和KEGG信號通路顯著性富集分析，確定基因表達(dá)譜中的主要基因功能和參與的主要信號通路。

2 結(jié) 果

2.1 基因芯片數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因分析(differentially expressed genes，DEGs) 有表達(dá)的基因共29871個，通過差異基因分析發(fā)現(xiàn)，PCOS子宮內(nèi)膜增生病變組織中存在表達(dá)差異的基因共810個，其中上調(diào)基因408個(249個顯著基因)，下調(diào)基因402個(344個顯著基因)，見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因聚類分析圖

2.2 差異基因的GO富集分析 GO生物學(xué)過程富集類別128個，分子功能富集類別23個，細(xì)胞組成富集類別19個。其中生物學(xué)過程中富集類別包括Wnt信號通路的負(fù)調(diào)控、上皮形成、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、蛋白水解作用、MAPK的激活、基因表達(dá)的正調(diào)控、成纖維細(xì)胞生長因子刺激的細(xì)胞反應(yīng)等。分子功能富集類別包括整合素蛋白的結(jié)合、鈣離子的結(jié)合、生長因子活性、基因金屬蛋白酶活性、Wnt蛋白的結(jié)合等。

2.3 基因Pathway通路分析 利用京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫中pathway功能對差異基因進(jìn)行代謝通路分析，篩選出了23條顯著性代謝通路的差異基因，如有Wnt信號通路(hsa04310:Wnt signaling pathway)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(hsa04060:Cytokine-cytokine receptor interaction)、PI3K-Akt信號通路(hsa04151:PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信號通路(hsa04010:MAPK signaling pathway)。

通過對差異基因GO富集分析和Pathway通路分析，在生物學(xué)功能方面，Wnt信號通路的負(fù)調(diào)控(q-value=4.96E-05)具有顯著差異。利用KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路中涉及8個基因，其中2個差異基因表達(dá)下調(diào)(SFRP1=-2.70、SFRP4=-4.55)，6個差異基因表達(dá)上調(diào)(WIF1=11.88、DKK4=9.40、NKD1=8.93、WNT6=4.65、BAMBI=3.79、PRKCG=2.99)，均表達(dá)顯著差異。證實Wnt信號通路分子的失調(diào)可能與PCOS子宮內(nèi)膜發(fā)生增生病變關(guān)系密切。見表1、圖2。

表1 Wnt信號通路基因

圖2 PCOS-EH組織中Wnt失調(diào)信號傳導(dǎo)通路注：根據(jù)NICB文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫查詢KEGG Wnt signaling pathway所涉及的8個基因，在Wnt信號通路中推定的作用機(jī)制及途徑，其中“-”表示抑制作用，“+”表示激活作用，“?”表示該基因在Wnt信號傳導(dǎo)通路中還具有其他的傳導(dǎo)途徑

3 討 論

3.1 PCOS子宮內(nèi)膜病變中存在差異表達(dá)基因 PCOS患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、分化、凋亡受到各種因素的影響，如無孕激素抵抗、高雄激素、高胰島素、糖脂代謝紊亂等，這些高危因素破壞子宮內(nèi)膜正常的生理病理，促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的有絲分裂活躍，可能導(dǎo)致植入失敗、不孕、子宮內(nèi)膜增生甚至子宮內(nèi)膜癌[2]。然而，PCOS-EH子宮內(nèi)膜發(fā)生異常增生的病理生理學(xué)的作用機(jī)制尚未探索及明確。

目前關(guān)于PCOS正常子宮內(nèi)膜的基因表達(dá)譜已有研究報道[3]，但國內(nèi)外關(guān)于PCOS子宮內(nèi)膜增生病變相關(guān)基因表達(dá)的研究尚缺乏。本研究利用全基因組芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，PCOS-EH與PCOS-E患者的子宮內(nèi)膜具有不同的基因表達(dá)譜，PCOS-EH子宮內(nèi)膜組織中存在多種差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因408個(249個顯著基因)，下調(diào)基因402個(344個顯著基因)，如明顯差異表達(dá)上調(diào)的基因有胞漿磷脂酶A2(PLA2G4D)、黏附蛋白1(MUCL1)、谷氨酸脫酸酶1(GAD1)、Wnt抑制因子1(WIF1)等，明顯差異表達(dá)下調(diào)的基因有前列腺素F受體(PTGFR)、前列腺相關(guān)蛋白4(PAGE4)、黏附蛋白1類樣蛋白1(MUM1L1)、類胰蛋白酶1(TPSAB1)等。

3.2 PCOS子宮內(nèi)膜病變與Wnt信號通路存在相關(guān)性 研究顯示，Wnt家族成員可能與多種炎性疾病有關(guān)，包括糖尿病、視網(wǎng)膜病變、炎癥性腸炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。既往研究多關(guān)注于Wnt信號通路異常表達(dá)對PCOS患者慢性炎癥、脂質(zhì)代謝[4]的影響。如有研究發(fā)現(xiàn)[5]，Wnt3a低表達(dá)可能使炎癥因子的分泌增加，從而導(dǎo)致PCOS低度慢性炎癥狀態(tài)的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)[6]，PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞異常與Wnt信號通路有關(guān)，Wnt/β-catenin/Foxo 3a軸為治療PCOS疾病的潛在靶點。參與炎癥、脂質(zhì)代謝和Wnt信號傳導(dǎo)的基因在非肥胖PCOS脂肪組織中差異表達(dá)，微陣列分析顯示多個Wnt信號基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化，包括DKK2(增加1.9倍)、JUN(減少4.1倍)和FOSB(減少60倍)。

本研究通過對差異基因GO富集分析和Pathway通路分析，發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路負(fù)調(diào)控(q-value=4.96E-05)具有顯著差異，2個差異基因表達(dá)下調(diào)(SFRP1=0.37、和SFRP4=0.22)，6個差異基因表達(dá)上調(diào)(WIF1=11.88、DKK4=9.40、NKD1=8.93、WNT6=4.65、BAMBI=3.79、PRKCG=2.99)，表達(dá)均顯著差異。證實Wnt信號通路分子的失調(diào)與PCOS子宮內(nèi)膜發(fā)生增生病變關(guān)系密切。

3.3 PCOS子宮內(nèi)膜病變與Wnt信號通路作用機(jī)制 Wnt信號通路是一種高度保守傳導(dǎo)途徑，在許多生物發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。Wnt信號通路有兩條[7]，一條是經(jīng)典β-catenin依賴性通路，另外一條是非經(jīng)典β-catenin不依賴性通路，其中非經(jīng)典途徑有兩條細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)途徑：平面細(xì)胞極性通路(PCP)和Wnt/Ca2+通路。本研究發(fā)現(xiàn)，激活非經(jīng)典通路的Wnt6基因、蛋白激酶C-γ(PRKCG)基因[8]表達(dá)明顯上調(diào)(FC=4.65，F(xiàn)C=2.99)，證實PCOS子宮內(nèi)膜增生病變發(fā)生發(fā)展與Wnt非經(jīng)典傳導(dǎo)途徑的異常激活密切相關(guān)。

WIF1、NKD1都是Wnt信號通路中經(jīng)典途徑的抑制劑，其功能現(xiàn)已較明確[9]。Dickkopfs蛋白家族(DKK4)表達(dá)變化有差異[10]，相對其他抑制劑了解較少，在Wnt信號通路的分子機(jī)制作用中尚不明確。骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑(BAMBI)是經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑的正調(diào)節(jié)劑。本研究中，BAMBI表達(dá)基因上調(diào)(FC=3.79)，經(jīng)典途徑的抑制因子分泌卷曲相關(guān)蛋白(SFPR1、SFPR4)表達(dá)下降，這與既往在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)研究相一致[11]，表明經(jīng)典途徑的激活和抑制減少仍對疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但本研究發(fā)現(xiàn)，WIF1、NKD1抑制基因表達(dá)上調(diào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于BAMBI基因的上調(diào)和SFRR1、SFPR4基因的下調(diào)(11.88、8.93 vs 0.37、0.22)，在整體上可能仍表現(xiàn)為Wnt經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑的抑制。另外，SFPR4并不是單純只抑制經(jīng)典傳導(dǎo)途徑，SFPR4也能抑制Wnt信號傳導(dǎo)通路的非經(jīng)典途徑。Carmon等[12]也發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌中，Wnt7a能通過跨膜卷曲受體(Fzd10)激活平面細(xì)胞極性/JNK依賴性非經(jīng)典信號傳導(dǎo)，并且信號可被SFRP4抑制，SFRP4基因的下調(diào)，表明非經(jīng)典途徑的抑制減少與子宮內(nèi)膜癌的腫瘤細(xì)胞侵襲作用關(guān)系密切。

綜上所述，PCOS-EH與PCOS-E患者子宮內(nèi)膜組織中存在明顯基因表達(dá)譜差異，涉及Wnt信號通路傳導(dǎo)異常，且主要與Wnt信號通路的非經(jīng)典途徑激活和經(jīng)典途徑的抑制相關(guān)，這組基因可作為早期預(yù)測子宮內(nèi)膜增生病變的生物標(biāo)記物。