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        鞣花酸對DSS誘導的潰瘍性腸炎小鼠的改善及對COX2/p38/JNK/ERK/IκB-α/NF-κB和iNOS/3-NT/CYP2E1信號通路的作用

        2022-08-08 03:21:00姜林娟樸丙熙權英珠
        食品與藥品 2022年4期
        關鍵詞:小鼠血清模型

        鄭 志 ,姜林娟,朱 瑜,樸丙熙, ,權英珠

        (1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院,河南 新鄉(xiāng) 453000;2. 韓陵醫(yī)藥研究院有限公司,江蘇 南京211100;3. 萊帕堅(株)公司,韓國 首爾 04393;4. 梨花女子大學 藥學院,韓國 首爾 04393)

        潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種急性或慢性腸道炎性疾病,其間潰瘍反復發(fā)生[1]。局部長期慢性炎癥的結果是腸纖維化,慢性炎癥的反復刺激會使細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過多沉積,從而導致管腔直徑減小、腸道狹窄甚至會發(fā)生腸梗阻,加重患者癥狀[2]。UC在我國的發(fā)病率迅速升高,尤其慢性UC已成為常見的消化系統(tǒng)疾病[3-4]。慢性UC的病程遷延反復,需長期用藥和復查,不僅給患者帶來巨大的身心痛苦和沉重的經濟負擔,也耗費了大量的醫(yī)療資源。目前慢性UC尚無規(guī)范化治療,發(fā)病機制至今尚未完全明確。鞣花酸是一種天然酚類,主要分布于堅果、軟果中,具有抗氧化、抑制增殖、誘導凋亡、阻斷病毒感染、抑制炎癥等生物活性功效[5]。研究報道,含鞣花酸成分的扎沖十三味丸通過多靶點調控,發(fā)揮抗炎作用,但其組成成分較多,化學成分復雜,復方物質基礎及作用機制還需進一步探究[6]。本研究采用硫酸葡聚糖鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導UC動物模型,探討鞣花酸對UC的改善效果及對環(huán)氧化酶2(COX2)、蛋白激酶p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)、核因子κB抑制蛋白α(IκB-α)、核因子κB(NF-κB)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、3-硝基酪氨酸(3-NT)、細胞色素P450 2E1(CYP2E1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1(IL-1)及一氧化氮(NO)水平的影響。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        Micro17微量離心機(美國Thermo Scientific公司);SX-300高溫高壓滅菌鍋(日本Tomy公司);SDS-PAGE電泳儀(美國Bio-Rad公司);ECL Plus蛋白質印跡檢測系統(tǒng)(美國Cytiva公司);HR-6型手持式組織勻漿機(上海瀘析公司);CX21光學生物顯微鏡(日本Olympus公司);Pannoramic MIDI數字切片掃描儀(匈牙利3DHistech公司)。

        1.2 材料

        鞣花酸(美國Sigma-Aldrich,純度>99 %);DSS[美國安培生物醫(yī)療器械貿易(上海)有限公司];iNOS,3-NT,CYP2E1,COX2,磷酸化JNK(p-JNK),磷酸化ERK(p-ERK),磷酸化p38(p-p38),磷酸化IκB-α(p-IκB-α),磷酸化NF-κB(p-NF-κB)抗體及其二抗,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,美國圣克魯斯生物技術公司)。PierceTMBCA蛋白定量檢測試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司);TNF-α,IL-1β,NO酶聯免疫試劑盒(美國R&D Systems公司)。

        1.3 動物

        30只雄性8周齡BALB/c小鼠購于北京維通利華實驗動物有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22±2 ℃、濕度55 %±8 %,正常飲食,12 h白/暗調節(jié)(07:00~19:00)環(huán)境。

        2 方法

        2.1 DSS誘導炎癥小鼠模型及動物分組

        DSS劑量參考文獻[5,7]設置,預實驗后確定為60 mg/kg。小鼠進行一周適應性飼養(yǎng),隨機分為3組,每組10只,分別為:正常組,自由飲水+經口灌胃生理鹽水;模型組,自由飲用5 % DSS溶液+經口灌胃生理鹽水溶液;給藥組,自由飲用5 %DSS溶液+經口灌胃鞣花酸溶液(7 g/L)。連續(xù)7 d。所有動物實驗均在新鄉(xiāng)醫(yī)學院倫理委員會的倫理審查和監(jiān)督下完成。

        2.2 生物組織樣本的采集

        實驗結束后,所有動物用CO2處死,心臟采血,12 000 r/min離心10 min,吸取上層血清,-70 ℃保存。從底部切除腸組織5 cm,肉眼觀察其損傷程度,并稱重。剪出離肛門1 cm的腸組織,用PBS(pH 7.4)緩沖溶液洗3次,稱重。取5 mg組織,添加含0.5 %十六烷基三甲基溴化銨的50 mmol/L PBS(pH 6.0),用手持式組織勻漿機勻漿3次,每30 s一次;-70 ℃冷凍3 h,37 ℃條件下解凍,其過程反復3次。組織勻漿液在12 000g條件下離心15 min,取上層液, -70 ℃保存。其他腸組織和肝組織用4 ℃預冷生理鹽水沖洗3遍,放入10 %中性福爾馬林溶液中,用于組織病理學分析。

        2.3 小鼠結腸和肝組織病理學分析

        采用傳統(tǒng)蘇木素-伊紅染色法(hematoxylineosin staining,HE)進行。將固定好的胃和結腸組織水洗,依次經不同濃度乙醇溶液和無水乙醇脫水,用二甲苯和石蠟混合液包埋,切片,厚度為5 μm,烘干,HE染色,封片,用Pannoramic MIDI數字切片掃描儀對各組織切片進行掃描拍照,觀察上皮細胞的損傷及炎癥浸潤等。

        2.4 血液中炎癥因子水平測定

        采用酶聯免疫試劑盒測定小鼠血清中TNF-α、IL-1β和NO水平。

        2.5 Western blot檢測

        用PierceTMBCA蛋白定量檢測試劑盒檢測各結腸勻漿液中蛋白質濃度。取勻漿液(蛋白質含量50 μg)進行SDS-PAGE電泳,蛋白轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后,于5 %脫脂奶粉中封閉,再分別經iNOS、3-NT、CYP2E1、COX2、p-JNK、p-ERK、p-p38、p-IκB-α及p-NF-κB抗體標記,室溫下孵育過夜,三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(TBST)洗3次,二抗孵育2 h,再用TBST洗3次,最后用高效化學發(fā)光液(ECL)顯色,利用ECL Plus蛋白質印跡檢測系統(tǒng)拍照記錄并分析。以上操作重復3次。

        2.6 統(tǒng)計分析

        數據均以平均值±標準差表示,通過SPSS16.0處理分析數據,組間樣本比較采用t檢驗,P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

        3 結果

        3.1 鞣花酸對UC小鼠結腸和肝臟的影響

        鞣花酸對UC小鼠結腸和肝臟的影響見圖1。由圖1可見,DSS誘導的UC小鼠結腸明顯縮短變窄,均有萎縮、充血、潰瘍和壞死等表現,結腸的長度為4.2±0.8 cm,結腸重量為0.4±0.1 g,肝臟重量為0.6±0.2 g,與正常組小鼠(結腸長度為7.5±1.0 cm,結腸重量為0.8±0.1g,肝臟重量為1.7±0.3 g)相比,顯著降低(P<0.05),表明5 %DSS誘導的UC小鼠模型成功建立。給藥組小鼠結腸表面光澤、完整,未出現萎縮、充血、潰瘍、壞死等,結腸無明顯縮短、變窄。結果還顯示,給藥組小鼠與模型組小鼠相比,結腸的長度(5.9±0.7 cm)、重量(0.6±0.1 g)顯著恢復(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。此外,給藥組小鼠的肝臟重量為1.2±0.2 g,與模型組小鼠相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明鞣花酸具有改善急性UC的作用。

        圖1 鞣花酸對潰瘍結腸炎小鼠結腸和肝臟的影響(n=10)

        3.2 小鼠結腸和肝組織病理學分析結果

        病理分析結果見圖2、圖3。由圖2可見,模型組小鼠結腸組織中發(fā)現大量炎細胞浸潤,隱窩消失、環(huán)狀細胞減少,黏膜下層出現水腫。給藥組小鼠的結腸上皮細胞完整,隱窩、環(huán)狀細胞損傷、水腫程度較輕。由圖3可見,模型組小鼠肝細胞出現大量細胞核破壞和損傷(圖3B箭頭所示),但給藥組小鼠肝臟未發(fā)現明顯損傷(圖3C箭頭所示),說明鞣花酸能減輕腸和肝臟組織的炎癥程度和組織學損傷。

        圖2 小鼠結腸組織病理學分析結果(HE染色×200)

        圖3 小鼠肝臟組織病理學分析結果(HE染色×200)

        3.3 血清炎癥因子水平

        血清炎癥因子測定結果見圖4。血清中TNF-α,IL-1β,NO高水平表達是急性炎癥的典型特征。模型組小鼠血清中TNF-α水平為415±22 ng/L,IL-1β水平為720±30 ng/L,NO水平為 635±20 mol/L,與正常組(TNF-α水平為390±26 ng/L,IL-1β水平為570±50 ng/L,NO水平為550±12 mol/L)相比,均顯著增高(P<0.05)。給藥組小鼠的TNF-α水平為370±10 ng/L,IL-1β水平為420±30 ng/L,NO水平為530±20 mol/L,與模型組小鼠比較,顯著降低(P<0.05),說明鞣花酸能抑制血清中炎癥因子的表達,這與組織病理學分析結果一致。

        圖4 血液中炎癥因子(TNF-α,IL-1β,NO)表達水平測定結果(n=10)

        3.4 抗氧化因子Western blot檢測結果

        抗氧因子能通過抑制自由基的產生,清除、熄滅活性氧自由基,從而減少基因或蛋白質的氧化損傷。小鼠血清中抗氧化因子(iNOS、3-NT、CYP2E1)的Western blot檢測結果見圖5。模型組小鼠血清中iNOS(100±4.1)、3-NT(100±6.0)、CYP2E1(10 240±10.0)的表達水平,與正常組(iNOS為25±5.0、3-NT為40±4.1、CYP2E1為23±3.2)相比明顯增高(P<0.01)。給藥組小鼠的iNOS(54±4.2)、3-NT(70±4.0)、CYP2E1(53±3.1)的表達水平,與模型組小鼠相比明顯被抑制(P<0.05),說明鞣花酸能抑制抗氧化因子,這與血清中炎癥因子分析結果一致。

        圖5 抗氧化因子(iNOS,3-NT,CYP2E1)Western blot檢測結果(n=10)

        3.5 抗炎癥因子Western blot檢測結果

        COX2及MAPK信號通路磷酸化激活后轉錄因子(p-ERK,p-p38,p-IκB-α,p-NF-κB)是主要抗炎癥因子,小鼠血清中抗炎癥因子的Western blot檢測結果見圖6。DSS誘導的小鼠血清中COX2(100±5.0)、p-JNK(100±6.1)、p-ERK(100±8.2)、 p-p38(100±4.0)、p-IκB-α(100±3.9)、p-NF-κB(100±8.2)的表達水平與正常組(COX2為41±4.1、p-JNK為44±3.9、p-ERK為62±6.0、p-p38為70±8.1、p-IκB-α為56±5.9、p-NF-κB為25±10.0)相比,均顯著增高(P<0.05)。鞣花酸處理的試驗組小鼠的抗炎癥因子表達水平(COX2為46±6.0、p-JNK為62±6.0、p-ERK為75±2.1、p-p38為82±5.9、p-IκB-α為63±4.1、p-NF-κB為40±3.0)與模型組小鼠比較,均顯著被抑制(P<0.05),說明鞣花酸能抑制抗氧化因子,這與血清中炎癥因子和抗氧化因子水平分析的結果一致。

        圖6 抗炎癥因子Western blot檢測結果(n=10)

        4 討論

        本研究選取天然酚類──鞣花酸,探討其對5 %DSS誘導的UC小鼠的影響,發(fā)現鞣花酸對UC小鼠的結腸和肝臟組織具有改善作用,能緩解炎癥程度和組織學損傷,其作用與MAPK/IκB-α/NF-κB/COX2炎癥信號通路與CYP2E1/iNOS/3-NT氧化應激通路有關。

        4.1 鞣花酸抑制MAPK/IκB-α/NF-κB/COX2炎癥信號通路

        MAPK信號通路的主要樞紐包括p-38、JNK、ERK等,通過調節(jié)關鍵樞紐, 介導細胞炎癥反應、細胞增殖、凋亡等[7]。其中,磷酸化激活后的JNK(p-JNK)是各種應激原作用中信號傳導的關鍵因子;磷酸化激活后的ERK(p-ERK)是多種炎癥反應中的必須因子;磷酸化激活后的p-38(p-p-38)參與細胞炎癥和凋亡。故轉錄因子p-JNK、p-ERK、p-p-38是治療UC的重要的藥物靶點[8]。有研究報道,MAPK下游的核轉錄因子NF-κB調控多種促炎因子的表達,并參于炎癥性腸病[8],而NF-κB的抑制蛋白IκB是此通路的中間環(huán)節(jié)。NF-κB和IκB參與急性/慢性炎癥、組織纖維化、細胞凋亡等病理生理過程,還能調控促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等的轉錄水平[9]。其中,TNF-α是炎癥反應相關重要啟動細胞因子,在UC發(fā)生時其高表達可加重炎癥反應,誘導病理性損傷的增大。IL-1β是由巨噬細胞和單核細胞分泌,介導機體炎癥調控與免疫應答,其高表達與UC炎癥的發(fā)生也有密切關系[10]。Yu等[11]報道有效抑制NF-kB和MAPK信號通路,便會減少促炎細胞因子的產生。本研究的結果顯示鞣花酸顯著降低模型小鼠血清TNF-α、IL-1β釋放(P<0.05),認為這可能與MAPK/IκB-α/NF-κB通路的抑制有關。

        此外,NF-κB能下游調控COX2的轉錄,導致COX2表達增多,從而促進多種炎性遞質產生,擴大和持續(xù)炎癥發(fā)生[12]。本研究發(fā)現,模型組動物結腸組織中COX2、IκB-α、NF-κB、p-JNK、p-ERK、p-p38蛋白表達顯著高于正常組(P< 0.05),說明該炎癥細胞因子群的高表達與DSS誘導的UC發(fā)生發(fā)展密切相關。上述細胞因子屬于炎癥信號通路的關鍵因子,因此,鞣花酸可能是基于MAPK/IκB-α/NF-κB/COX2炎癥通道發(fā)揮抗炎作用,從而顯著減少促炎細胞因子TNF-α、IL-1β的釋放。

        4.2 鞣花酸抑制CYP2E1/iNOS/NO/3-NT氧化通路

        疾病條件下,氧化應激的增加可增加炎性細胞因子釋放,而炎性細胞因子的增加可刺激自由基的產生,從而誘導氧化應激。有研究表明,CYP2E1在脂肪酸氧化過程中產生過量的ROS[13], 誘導iNOS的生成,進而調節(jié)血紅素氧合酶1(HO-1)表達[14]。而超氧化物存在下形成的NO高表達,通過與蛋白質上的酪氨酸殘基反應形成3-NT,導致包括非酒精性脂肪性肝病或阻塞性肺病等高氧性組織損傷。UC患者發(fā)炎黏膜中的管腔隱窩細胞、中性粒細胞和單核細胞中的 3-NT 表達也增加[15]。本研究結果發(fā)現,模型組動物血液和結腸組織中CYP2E1、iNOS、NO、3-NT的表達顯著均高于正常組(P<0.05),說明CYP2E1/iNOS/NO/3-NT通路與DSS誘導的UC發(fā)生密切相關。鞣花酸對UC小鼠模型結腸組織中過量表達的CYP2E1、iNOS、NO、3-NT均有下調作用(P<0.05), 表明鞣花酸改善UC可能是基于對CYP2E1/iNOS/3-NT抗氧化應激通路的抑制。本研究的病理組織形態(tài)學結果表明,鞣花酸顯著改善了DSS誘導的UC小鼠的腸和肝臟組織的炎癥程度和組織學損傷。

        綜上,本研究發(fā)現鞣花酸抑制MAPK/IκB-α/NF-κB/COX及CYP2E1/iNOS/3-NT通路,從而顯著減少TNF-α、IL-1β、NO釋放,進而產生改善UC的作用。但抗氧抗炎涉及信號通路較多,本研究還有待于更深入探索。

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