李彥君，漆愛明，肖樹雄，曾子君

（廣東省藥品檢驗所 國家藥品監(jiān)督管理局化妝品風險評估重點實驗室，廣東廣州 510300）

2019年11月起，歐盟委員會允許增加具有防腐和調理皮膚功能的羥基乙氧基苯基丁酮作為化妝品防腐劑。對羥基苯乙酮是一種天然植物提取物，具有防腐增效的作用，在較寬的pH和溫度范圍內都有優(yōu)異的穩(wěn)定性。對茴香酸是一種天然存在于茴香中的有機酸，在酸性條件下可防止真菌霉素的合成，具有抗菌的功效。辛酰羥肟酸是一種有機酸，是選擇性強的金屬離子螯合劑，因其優(yōu)異的抑菌性能被廣泛應用于化妝品中，在國外也有廣泛應用。

對羥基苯乙酮、對茴香酸和辛酰羥肟酸均在《已使用化妝品原料名稱目錄（2021年版）》[1]中，由于都具有抑菌的功效，同時不屬于《化妝品安全技術規(guī)范》中準用的51類防腐劑[2]，常被商家添加到化妝品中并宣稱為“無防腐劑”化妝品，也稱之為防腐替代方案[3]。防腐替代方案普遍使用時間不長，缺乏安全評估數據，有必要對其添加量進行監(jiān)管。目前，羥基乙氧基苯基丁酮尚未有國家標準檢測方法，其余3種物質都只有單組分檢測方法，無法應用于多組分的同時測定[4-11]。因此本文通過建立相應的檢測方法，以期為監(jiān)管表外防腐劑的添加情況提供技術支撐，同時為監(jiān)管部門日后制定相關限值要求提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

對羥基苯乙酮，純度98.25%，上海麥克林生化科技有限公司；羥基乙氧基苯基丁酮，純度97%，加拿大TRC公司；對茴香酸，純度99%，上海麥克林生化科技有限公司；辛酰羥肟酸，純度99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇，色譜純，德國默克公司；磷酸，分析純，廣州化學試劑廠。

島津LC-20A液相色譜儀，日本SHIMADZU公司；Milli Q Reference超純水發(fā)生器，MILLIPORE公司；XS205DU十萬分之一電子天平，瑞士METTLER公司；CPA224S萬分之一電子天平，德國SARTORIUS公司；ElmaDE-78224超聲波清洗器，廣州市東南科創(chuàng)科技有限公司。

樣品來源：市面上購買，有針對性選取14批標簽標識有文中4種表外防腐劑的樣品及5批未標識有文中4種表外防腐劑的樣品。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測器PDA，流動相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液（體積比20∶20∶60），等度洗脫，流速1 mL/min，掃描波長190～400 nm，檢測波長275 nm和210 nm，柱溫30 ℃，進樣量5 μL。

1.2.2 標準溶液的配制

分別精密稱取50 mg標準物質于不同25 mL容量瓶中，加入少量甲醇溶解后，用甲醇定容至刻度，搖勻，得單標儲備液。精密吸取對羥基苯乙酮和對茴香酸各0.4 mL、羥基乙氧基苯基丁酮和辛酰羥肟酸各2 mL于20 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，得標準混合溶液。分別精密吸取標準混合溶液0.125 mL、0.625 mL、1.250 mL、2.500 mL、5.000 mL和10.000 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得系列標準溶液。上機前均經0.45 μm濾膜過濾。

1.2.3 樣品處理

稱取樣品1.0 g（精確至0.000 1 g）于10 mL具塞比色管中（必要時，置于水浴中去除乙醇等揮發(fā)性有機溶劑），加甲醇定容至刻度，渦旋混勻，300 W超聲提取20 min。經0.45 μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

本研究分別考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液（體積比45∶55）、乙腈-0.1%磷酸水溶液（體積比35∶65）、甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（體積比20∶20∶60）對4種表外防腐劑出峰情況的影響。由于部分化妝品存在同時添加表外防腐劑和表內防腐劑的情況，因此建立的方法應有效分離對茴香酸與常用防腐劑羥苯甲酯。結果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液條件下，對茴香酸與羥苯甲酯出峰時間接近，光譜圖相似，存在干擾。而乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相時，各組分分離度和洗脫用時均優(yōu)于甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相。因此，選擇乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相，各組分分離情況如圖1所示。。

圖1 標準溶液色譜圖

2.2 檢測波長的選擇

在190～400 nm波長范圍內進行光譜掃描。結果顯示，對羥基苯乙酮、對茴香酸和羥基乙氧基苯基丁酮的最大吸收波長分別為275 nm、254 nm和281 nm，在滿足靈敏度的前提下，為便于檢測，選擇275 nm為該3種組分的檢測波長。根據參考文獻[11]選擇210 nm作為辛酰羥肟酸的檢測波長。

2.3 樣品前處理條件的選擇

研究甲醇和乙腈分別作為4種表外防腐劑提取溶劑時，在相同的色譜條件下，對目標物質的響應差異。結果表明，用甲醇作為提取溶劑時，各目標物質的響應均明顯優(yōu)于乙腈，且甲醇毒性低于乙腈。因此，選擇甲醇作為對照品提取溶劑。為減少溶劑效應，選取甲醇作為樣品的提取溶劑。

以甲醇為提取溶劑，考察不同基質化妝品在不同超聲時間下的回收率。在300 W超聲功率下，選取了10 min、20 min和30 min 3個時間點研究超聲時間與提取率關系。結果顯示，各基質化妝品超聲提取20 min以上提取率沒有明顯變化。因此選擇以甲醇作為提取溶劑，超聲20 min作為樣品前處理條件。

2.4 線性關系

以各組分標準溶液濃度（mg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，實驗結果見表1。結果顯示，對羥基苯乙酮、對茴香酸、羥基乙氧基苯基丁酮和辛酰羥肟酸在一定濃度范圍內呈現良好的線性關系。相關系數均大于0.999 5。按S/N=3計算得出檢出限分別為 0.5 μg/g、1.0 μg/g、2.4 μg/g和7.5 μg/g（該濃度表示化妝品中的含量）。

2.5 回收率

取液體、乳液和膏霜3種不同基質的空白樣品，分別添加3個濃度水平的標準溶液進行加標回收實驗，每一水平設6個平行，按1.2.3樣品前處理方法制備待測樣品，標準曲線法定量，計算回收率和精密度。由表2～5可知，該方法的回收率為92.3%～103.3%，相對標準偏差RSD≤1.7%。結果表明該方法具有良好的準確度。

表3 對茴香酸平均回收率和RSD

表4 羥基乙氧基苯基丁酮平均回收率和RSD

表5 辛酰羥肟酸平均回收率和RSD

2.6 精密度

考察了低、中、高3個質量濃度標準溶液的精密度，日內分析6次，連續(xù)測定3 d。由表6可知，各組分日內精密度RSD為0.1%～1.0%；日間精密度RSD為0.3%～1.2%。實驗證明，該方法精密度高。

表6 日內精密度和日間精密度（n=6）

2.7 重復性試驗

平行配制6份供試品溶液，在相同條件下上機測量，以6次測定值來考察方法重復性，計算得對羥基苯乙酮、對茴香酸、羥基乙氧基苯基丁酮和辛酰羥肟酸RSD分別為0.2%、0.2%、0.6%和1.2%（n=6），表明該方法重復性好。

2.8 實際樣品測定

應用所建立的方法，對19批次3種不同劑型的化妝品進行測定，并與標簽進行對比，結果見表7。

表7 樣品標簽標識情況和檢出情況

對19批樣品檢測結果進行分析。（1）共有3批檢出標簽未標示組分對羥基苯乙酮，說明加入這些物質而未標識十分普遍。（2）羥基乙氧基苯基丁酮雖已列入歐盟準用名單，但目前國內還未列入已使用目錄，產品中沒發(fā)現添加，是否納入國內準用表有待研究后確定。（3）樣品中對羥基苯乙酮的含量在0.16%～0.69%、對茴香酸的含量在0.065%～0.090%、辛酰羥肟酸的含量在0.010%～0.048%，目前對這幾個物質還沒設定限值，建議通過安全評估后設定合理限值。

3 結論

本文建立了高效液相色譜法測定化妝品中4種表外防腐劑的含量測定方法。以甲醇作為提取溶劑，300 W超聲提取20 min，采用C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行分離。經過方法學考查，線性、回收率、精密度和重復性結果均在規(guī)定范圍內，具有良好的適用性，為化妝品中4種表外防腐劑的含量測定提供了參考依據，能夠進一步規(guī)范化妝品中防腐劑的使用。