王衍坤，沈怡，范佳琪，陳思旭，夏法剛，季彪俊

（福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院，福建 福州 350002）

甘藍(lán)型油菜（下稱“油菜”）是我國重要的油料作物之一，在世界上是僅次于大豆的油料作物[1]。油菜在為人類提供食用油的同時(shí)，也可以作為動(dòng)物飼料、生物燃料等為人類生產(chǎn)生活提供豐富的物質(zhì)材料，因此油菜的種植與研究對(duì)人類具有重要意義[2]。種子含油量是油菜最重要的品質(zhì)性狀之一，對(duì)油菜種子含油量進(jìn)行遺傳改良，可以滿足人們的食用需求。不同油菜種子材料之間的含油量差別明顯[3]，提高油菜種子含油量，一直以來都是油菜育種工作者的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

目前，在油菜種子含油量的遺傳分析和QTL 定位[4]、調(diào)控油脂合成關(guān)鍵基因的功能研究、油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)和代謝調(diào)控等方面取得了豐碩的研究成果。雖然油脂合成的代謝通路已經(jīng)研究透徹，但影響油菜種子含油量和調(diào)控油脂合成的因素多種多樣[5-6]，闡釋這些因素對(duì)油脂合成調(diào)控的機(jī)理，有助于加快油菜高含油量分子育種的進(jìn)程。在種子發(fā)育的過程中，許多基因在不同階段所發(fā)揮的作用也不盡相同，因此，分析種子發(fā)育過程中油脂合成相關(guān)基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)水平以及在蛋白質(zhì)組水平上的代謝調(diào)控，有利于系統(tǒng)地解析油脂的合成過程，進(jìn)一步了解含油量的決定因子。

本試驗(yàn)利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，重點(diǎn)分析油菜種子不同發(fā)育時(shí)期油脂合成相關(guān)基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)水平，有利于加深對(duì)油菜油脂合成過程的了解，為后期高含油量油菜品種的選育以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在油菜分子遺傳上的有效運(yùn)用提供有力幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

甘藍(lán)型油菜“中9”為研究對(duì)象，取發(fā)育中（授粉后15 d）和成熟期種子作為試驗(yàn)材料，每個(gè)材料3 次重復(fù)。

1.2 RNA 提取、文庫構(gòu)建和高通量測(cè)序

剝?nèi)シN皮，只保留種子，用于RNA 提取。種子剝離后放入液氮冷凍，于-80 ℃保存。利用總RNA 提取試劑盒提取RNA，并于70%乙醇中-20 ℃長期保存。建庫和測(cè)序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 差異基因分析

測(cè)序的下機(jī)數(shù)據(jù)使用FastQC 進(jìn)行質(zhì)控，符合分析標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)而使用Trimmomatic 軟件進(jìn)行過濾，以去除低質(zhì)量的Reads（Trimmomatic 軟件參數(shù)如下：LEADING:3TRAILING:3SLIDINGWINDOW:4:15MINLEN:30）。使用STAR 軟件，將過濾后的reads 比對(duì)到油菜參考基因組序列上。接著，使用RSEM軟件對(duì)各個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本定量。使用定量分析的結(jié)果生成矩陣，構(gòu)造DESeq2 的輸入文件，進(jìn)行兩個(gè)組合之間的差異表達(dá)分析。P≤0.05 且|log2foldchange|＞1 的基因被認(rèn)為存在差異表達(dá)。

1.4 GO 分析

通過基迪奧生信分析平臺(tái)（https://www.omicshare.com/tools/）的GO 富集分析模塊實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的GO 富集分析（P＜0.05）。

1.5 KEGG 分析

使用KOBAS 3.0 軟件分析KEGG 通路中差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)富集，以P 調(diào)整值作為閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)基因分析

對(duì)油菜種子成熟期和發(fā)育期表達(dá)基因進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，共篩選得到油菜種子成熟期相對(duì)于發(fā)育期差異表達(dá)基因總數(shù)為36 294 個(gè)，其中上調(diào)轉(zhuǎn)錄基因數(shù)量為13 423 個(gè)，下調(diào)轉(zhuǎn)錄基因數(shù)量為22 871 個(gè)。

2.2 差異表達(dá)基因GO 注釋分析

通過對(duì)成熟期種子表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行GO 注釋（如圖1 所示）可知，生物過程中富集到基因條目數(shù)量最多的依次為代謝過程（GO:0008152，3 435 個(gè)基因）、細(xì)胞過程（GO:0009987，3 250 個(gè)基因）、單有機(jī)體過程（GO:0044699，2 091 個(gè)基因）等。細(xì)胞組件富集到基因條目數(shù)量最多的依次為細(xì)胞（GO:0005623，1 827個(gè)基因）、細(xì)胞部分（GO:0044464，1 827 個(gè)基因）等。分子功能富集到基因條目數(shù)量最多的依次為綁定（GO:0005488，6286 個(gè)基因）、催化活性（GO:0003824，3228 個(gè)基因）等。

圖1 油菜成熟期種子上調(diào)表達(dá)基因GO 注釋圖

通過對(duì)成熟期種子表達(dá)下調(diào)的基因進(jìn)行GO 注釋（如圖2 所示）可知，生物過程中富集到基因條目數(shù)量最多的依次為代謝過程（GO:0008152，6 262 個(gè)基因）、細(xì)胞過程（GO:0009987，5429 個(gè)基因）、單有機(jī)體過程（GO:0044699，4 589 個(gè)基因）等。細(xì)胞組件富集到基因條目數(shù)量最多的依次為細(xì)胞（GO:0005623，2 735 個(gè)基因）、細(xì)胞部分（GO:0044464，2 735 個(gè)基因）、膜（GO:0016020，2 294 個(gè)基因）等。分子功能富集到基因條目數(shù)量最多的依次為綁定（GO:0005488，8 925 個(gè)基因）、催化活性（GO:0003824，6 661 個(gè)基因）等。

圖2 油菜成熟期種子下調(diào)表達(dá)基因GO 注釋圖

差異表達(dá)基因GO 注釋分析結(jié)果表明，成熟期的油菜種子和發(fā)育期的油菜種子中表達(dá)差異基因在生物過程中都富集于代謝過程，在細(xì)胞組件一類中富集于細(xì)胞、細(xì)胞部分、膜和細(xì)胞器，在分子功能一類中富集于綁定。乙酰輔酶A 羧化酶是脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵酶，其主要存在于質(zhì)體和胞質(zhì)中，脂肪酸的合成是在葉綠體中完成。由此得以說明，油菜種子油脂合成和植物質(zhì)體的代謝過程有關(guān)。

2.3 差異表達(dá)基因KEGG 分析

根據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫，對(duì)差異上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行功能分類和Pathway 注釋，如圖3 所示，其中1 365 個(gè)基因注釋到115 條代謝途徑中，200 個(gè)基因富集到代謝通路途徑，注釋基因最多；156 個(gè)基因富集到核糖體途徑；104 個(gè)基因富集到次生代謝物生物合成途徑等。富集比例最高的是內(nèi)酰胺類抗生素途徑，富集比例為0.15，然后依次是0.14 的咖啡因代謝途徑、0.125 的酮體合成和降解途徑等。

圖3 油菜成熟期種子上調(diào)表達(dá)基因KEGG 富集分析

對(duì)差異下調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行功能分類和Pathway 注釋，如圖4 所示，其中1 653 個(gè)基因注釋到115 條代謝途徑中，337 個(gè)基因富集到代謝通路途徑，注釋基因最多；184 個(gè)基因富集到次生代謝物生物合成途徑等。富集比例最高的是光合作用-天線蛋白通路途徑和次級(jí)代謝物的生物合成通路途徑，富集比例為0.295，然后是富集比例為0.237 的光合作用途徑等。

圖4 油菜成熟期種子下調(diào)表達(dá)基因KEGG 富集分析

差異表達(dá)基因的通路分析表明，甘藍(lán)型油菜成熟期種子中差異表達(dá)基因上調(diào)與代謝通路、核糖體途徑等相關(guān)，上調(diào)基因富集于內(nèi)酰胺類抗生素途徑、咖啡因代謝途徑、酮體合成和降解途徑；差異基因下調(diào)則與代謝通路、次生代謝等相關(guān)，下調(diào)基因富集于光合作用-天線蛋白通路途徑和次級(jí)代謝物的生物合成通路途徑、光合作用途徑。相關(guān)研究表明，作為脂肪酸合成首步反應(yīng)的關(guān)鍵因子之一的ACCase，其活性受光限制，并且在油菜光合作用時(shí)，一些從葉綠體中產(chǎn)生的ATP和NADPH 會(huì)被用在脂肪酸的合成中。

2.4 油脂代謝相關(guān)基因動(dòng)態(tài)表達(dá)分析

通過對(duì)差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)基因中參與脂肪酸降解、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸代謝、脂肪酸延伸的基因分別有11 個(gè)、4 個(gè)、7個(gè)和2 個(gè)，下調(diào)基因中參與脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸代謝、脂肪酸延伸的基因分別有18 個(gè)、2 個(gè)、6 個(gè)、18 個(gè)和4 個(gè)，見表1。說明在油菜種子不同發(fā)育時(shí)期，參與脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸代謝、脂肪酸延伸等與油脂代謝相關(guān)的基因表達(dá)水平發(fā)生了明顯變化，共同調(diào)控油脂的合成與代謝。

表1 油菜種子油脂代謝相關(guān)差異表達(dá)基因匯總

3 結(jié)束語

油菜作為我國的主要油料作物，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活中占據(jù)著非常重要的地位。隨著國民經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和市場的需求，提高油菜品種的油脂含量成為了育種者的主要目標(biāo)之一。目前，國際上有許多關(guān)于油菜油脂合成相關(guān)基因的研究報(bào)道，但對(duì)這些基因如何調(diào)控油菜油脂合成等相關(guān)問題還有待科研工作者的后續(xù)研究。

本試驗(yàn)通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，對(duì)甘藍(lán)型油菜“中9”不同發(fā)育時(shí)期的種子樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，重點(diǎn)關(guān)注甘藍(lán)型油菜種子不同發(fā)育時(shí)期與油脂合成有關(guān)的基因表達(dá)變化，為研究油脂合成相關(guān)基因代謝調(diào)控機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為后期選育高含油量油菜品種和RNA-seq 在分子生物學(xué)上的有效運(yùn)用提供了支持。