魏晨旭 朱星宇,4 陸金蘭 夏晨潔 李偉東*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2.教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210023 3.江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023 4.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院，江蘇 淮安 223001

補(bǔ)骨脂為傳統(tǒng)補(bǔ)腎健骨類中藥，來源于豆科植物補(bǔ)骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)，具有溫腎助陽(yáng)、納氣平喘、溫脾止瀉的功效，用于腎陽(yáng)不足、陽(yáng)痿遺精、遺尿尿頻、腰膝冷痛等[1]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂及所含活性成分對(duì)骨質(zhì)疏松癥有著確切的治療作用，可以通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的平衡從而緩解骨質(zhì)疏松癥[2-3]。

黃酮類化合物是補(bǔ)骨脂中主要的一類化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松等活性[4]。課題組前期研究了補(bǔ)骨脂中9種黃酮類化合物對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化影響，發(fā)現(xiàn)在黃酮類化合物中，補(bǔ)骨脂中二氫黃酮類化合物對(duì)成骨細(xì)胞的增殖與分化作用最強(qiáng)[5]。骨質(zhì)疏松是由于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收平衡失調(diào)所致[6]，因此，本實(shí)驗(yàn)選取補(bǔ)骨脂中對(duì)成骨細(xì)胞作用最強(qiáng)的二氫黃酮類化合物，補(bǔ)骨脂二氫黃酮、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚考察其對(duì)破骨細(xì)胞分化的作用，并從NF-κB信號(hào)通路、PI3k/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)的角度探究其可能的作用機(jī)制，從而為補(bǔ)骨脂中二氫黃酮類化合物臨床治療骨質(zhì)疏松的進(jìn)一步應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，促進(jìn)其現(xiàn)代藥物的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)Memmert，INCO108)，電泳儀(美國(guó) Bio-rad Power Supplies Basic)；Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó) Bio-rad 170-4150)；凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó) SYNGENE G:BOXChemiXR5)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó) MD Spectramac M3)。

1.1.2藥物與試劑：小鼠骨髓單核細(xì)胞分離液試劑盒(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司，批號(hào)：TBD2013DM)，rmRANKL(R&D公司，Catalog Number 462-TEC，Lot CWA2118041)、rmM-CSF(R&D公司，Catalog Number 416-ML，Lot ME4418061)。抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)。GAPDH (10B8)(中國(guó) 江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司 KGAA002)。p38(中國(guó) 北京博奧森生物科技有限公司 bs-0637R)。p-p38(中國(guó) 北京博奧森生物科技有限公司 bs-0636R)。p-JNK、JNK、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38、p-p38(USA Cell Signaling Technology)。

異補(bǔ)骨脂二氫黃酮(Isobavachin)(純度≥98%，批號(hào)：111220)，補(bǔ)骨脂二氫黃酮(Bavachin)(純度≥98%，批號(hào)：101026)，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚(Bavachinin)(純度≥99%，批號(hào)：110502)，以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于南京世洲生物科技有限公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：ICR小鼠，5周齡(南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2014-0001，合格證編號(hào)：No.201813248。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1破骨細(xì)胞的提取及純化：破骨細(xì)胞的提取與純化主要參考前期研究的基礎(chǔ)[7]，步驟如下：第一天，取5周齡的ICR小鼠在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)分離出股骨或脛骨，并剪開骨頭兩端露出內(nèi)腔。勻漿沖洗液(產(chǎn)品編號(hào)：F2013TBD)沖洗出內(nèi)腔中的骨髓。反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液，以100 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾至10 mL離心管中。450 g，離心10 min。棄上清，加入樣本稀釋液(產(chǎn)品編號(hào)：2010C1119)重懸細(xì)胞，備用。另取一只5 mL玻璃采血管，依次加入分離液1、分離液2和細(xì)胞懸液(分離液1與分離液2體積比為3∶1，先后加入分離液 1∶4 mL、分離液2∶1.33 mL。)制成梯度界面。500 g，離心30 min，此時(shí)離心需使用水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)。離心后離心管中由上至下分為6層。吸取含有目的細(xì)胞的第二層環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層(第一層白環(huán)及上層 50%分離液2)到10 mL離心管中，加入5 mL洗滌液(產(chǎn)品編號(hào)：TBDTM-W)，混勻細(xì)胞。400 g，離心10 min。棄上清，加入5 mL清洗液(產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118)重懸所得細(xì)胞。250 g，離心10 min。棄上清后加入適量15%的FBS重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，向細(xì)胞懸液中加入巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)使其終濃度為30 ng/mL，將懸液吹打均勻，以密度1.8×105個(gè)/cm2種于96孔板中，每孔100 μL。

第二天，吸棄上清，換液，加入含100 ng/mL RANKL+50 ng/mL M-CSF和一定濃度藥物的15% FBS 280 μL。培養(yǎng)至第5天結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.2.2破骨細(xì)胞數(shù)量：于提取純化的第2天，細(xì)胞分為4組，分別給予補(bǔ)骨脂二氫黃酮(0.01、10、20、30、40 μmol/L)、異補(bǔ)骨脂二氫黃酮(0.1、5、10、15、30 μmol/L)、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚(0.01、1、10、20、30 μmol/L)，對(duì)照組不加藥物干預(yù)。培養(yǎng)第5天的破骨細(xì)胞，吸棄剩余上清液，4%多聚甲醛固定30 min，按照抗酒石酸酸性磷酸酶說明對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，經(jīng)電子顯微鏡拍照計(jì)數(shù)，拍得的圖片用Image J軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)算破骨細(xì)胞數(shù)量。

1.2.3抗酒石酸酸性磷酸酶活性：培養(yǎng)至第5天的破骨細(xì)胞，吸取上清液50 μL，按照抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒說明于405 nm條件下，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD值，計(jì)算破骨細(xì)胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性，并算出各EC50值。

1.2.4作用機(jī)制初步研究：(1)細(xì)胞分組。實(shí)驗(yàn)分為三大組，第一組測(cè)p65、p-p65蛋白表達(dá)，分為空白組、模型組(M-CSF+RANKL，記為M+R)、給藥組(Bavachinin+M-CSF+RANKL)、p65抑制劑組(PDTC 100 μmol/L+M-CSF+RANKL)；第二組測(cè)AKT、P-AKT蛋白表達(dá)，分為空白組、模型組(M-CSF+RANKL，記為M+R)、給藥組(Bavachinin+M-CSF+RANKL)、AKT激動(dòng)劑組(LM22B-10 20 μmol/L+Bavachinin+M-CSF+RANKL)；第三組測(cè)p38、p-p38、JNK、P-JNK、ERK、P-ERK蛋白表達(dá)，分為空白組、模型組(M-CSF+RANKL，記為M+R)、給藥組(Bavachinin+M-CSF+RANKL)、p38激動(dòng)劑組[Dehydrocorydaline chloride (DC)200 μmol/L+Bavachinin+M-CSF+RANKL]、JNK激動(dòng)劑組(Juglanin 10 μmol/L+Bavachinin+M- CSF+RANKL)、ERK激動(dòng)劑組(Honokiol，20 μmol/L+Bavachinin+M-CSF+RANKL)；其中空白組為不加因子刺激的單核細(xì)胞，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚給藥濃度為20 μmol/L，每組復(fù)3孔。給藥孵育1 h后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)Western blot。吸棄培養(yǎng)基后，加入預(yù)冷的PBS洗兩次，振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng)液，按照BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白通過10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜與含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1.5 h，與一抗p38(1∶200)、p-p38(1∶200)、JNK(1∶1000)、p-JNK(1∶1000)、ERK1/2(1∶1000)、p-ERK1/2(1∶1000)、AKT(1∶1000)、p-AKT(1∶1000)、NF-κB p65 (1∶1000)、p- NF-κB p65 (1∶1000)以及GAPDH (1∶10000)，4 ℃搖床振蕩孵育過夜。第二天取出，室溫振蕩30 min，吸棄一抗，TBST洗10 min×3次后，室溫與二抗孵育2 h。最后，ECL化學(xué)發(fā)光劑盒進(jìn)行染色，并用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比值表示目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 破骨細(xì)胞分化過程

如圖1所示，原代細(xì)胞培養(yǎng)分離第1天，細(xì)胞呈球形，較小，形態(tài)均一；第2天，單核細(xì)胞已經(jīng)貼壁，并且大小不一，可以明顯看到部分細(xì)胞生長(zhǎng)變大，并且部分細(xì)胞開始變形，呈不規(guī)則形。第3天，細(xì)胞開始長(zhǎng)出觸角，向周圍細(xì)胞發(fā)展，逐漸具有融合的趨勢(shì)。第4天，破骨細(xì)胞開始形成，呈不規(guī)則型，向四周聚集，出現(xiàn)大塊細(xì)胞融合區(qū)域。第5天為染色后的破骨細(xì)胞，細(xì)胞中心可以觀察到其細(xì)胞器的形狀及一些散在的細(xì)胞核。

2.2 補(bǔ)骨脂二氫黃酮類化合物對(duì)破骨細(xì)胞數(shù)量的影響

如圖2所示，與空白組相比，0.1～30 μmol/L的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚可以明顯減少破骨細(xì)胞的數(shù)量(P<0.05)，10～30 μmol/L的異補(bǔ)骨脂二氫黃酮可以明顯減少破骨細(xì)胞的數(shù)量(P<0.01)，20～40 μmol/L的補(bǔ)骨脂二氫黃酮可以明顯減少破骨細(xì)胞的數(shù)量(P<0.01)。以上結(jié)果說明，3種二氫黃酮類化合物對(duì)破骨細(xì)胞的形成均有一定的抑制作用。

2.3 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性的影響

如圖3所示，與空白組相比，1～30 μmol/L的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚可以明顯抑制破骨細(xì)胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性(P<0.05)，20～40 μmol/L的補(bǔ)骨脂二氫黃酮可以明顯抑制破骨細(xì)胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性(P<0.01)，5～30 μmol/L的異補(bǔ)骨脂二氫黃酮可以明顯抑制破骨細(xì)胞的抗酒石酸酸性磷酸酶活性(P<0.01)。以上結(jié)果說明，3種二氫黃酮類化合物對(duì)破骨細(xì)胞的形成均有一定的抑制作用。根據(jù)酶活性計(jì)算3個(gè)化合物對(duì)破骨細(xì)胞的EC50(μmol/L)，分別如下：補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚12.39，異補(bǔ)骨脂二氫黃酮15.18，補(bǔ)骨脂二氫黃酮15.89。由EC50值可以看出，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚在3個(gè)化合物中對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。

2.4 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)NF-kB信號(hào)通路蛋白的影響

如圖4所示，與模型組相比，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚可以明顯降低p-p65/p65的值(P<0.05)，說明補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚可以抑制p65的磷酸化。與p65磷酸化抑制劑PDTC對(duì)比，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組的p-p65/p65值高于PDTC組(P<0.05)，說明補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)p65的磷酸化有一定抑制作用，但抑制強(qiáng)度弱于PDTC。

2.5 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)PI3k/AKT信號(hào)通路蛋白的影響

如圖5所示，與模型組相比，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚可以顯著抑制AKT的磷酸化(P<0.01)。加入AKT磷酸化激動(dòng)劑LM22B-10后，AKT磷酸化抑制作用被減弱，與給藥組相比磷酸化水平明顯升高(P<0.01)。

2.6 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)MAPK信號(hào)通路蛋白的影響

如圖6所示，與模型組相比，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚可以顯著抑制ERK的磷酸化(P<0.01)，加入ERK磷酸化激動(dòng)劑Honoliol后，ERK磷酸化抑制作用被減弱，與給藥組相比磷酸化水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚可以顯著抑制p38的磷酸化(P<0.01)，加入p38磷酸化激動(dòng)劑DC后，p38磷酸化抑制作用被減弱，與給藥組相比磷酸化水平明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚可以顯著抑制JNK的磷酸化(P<0.01)，加入p38磷酸化激動(dòng)劑Juglanin后，JNK磷酸化抑制作用被減弱，與給藥組相比磷酸化水平明顯升高(P<0.01)。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)改變和脆性增加為主要特點(diǎn)的骨骼代謝性疾病，主要發(fā)生原因?yàn)槌晒羌?xì)胞與破骨細(xì)胞的平衡被打破[8]。

其中破骨細(xì)胞的過度激活是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要原因，因此抑制破骨細(xì)胞的活性，成為治療骨質(zhì)疏松癥的主要方法之一[9-10]。

抗酒石酸酸性磷酸酶是公認(rèn)的破骨細(xì)胞標(biāo)志之一，在骨吸收過程中參與骨基質(zhì)中礦化底物的降解，其活性強(qiáng)弱標(biāo)志著破骨細(xì)胞的活性，反映骨吸收的強(qiáng)弱[11]。本實(shí)驗(yàn)首先通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂中3種二氫黃酮類化合物均可以減少破骨細(xì)胞的數(shù)量。在此基礎(chǔ)上，檢測(cè)各組的酶活性，并計(jì)算EC50值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚在3個(gè)化合物中表現(xiàn)出最強(qiáng)的破骨細(xì)胞分化抑制作用。因此，選取補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚進(jìn)行進(jìn)一步的機(jī)制初步探討。

多條通路與骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中OPG/RANK/RANKL途徑對(duì)骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)具有重要作用。在OPG/RANK/RANKL信號(hào)通路中，單核細(xì)胞上的核因子-κB受體活化因子(RANK)被核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)激活后，引發(fā)多條信號(hào)傳導(dǎo)脈絡(luò)，可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化與增殖[3]。其中與破骨細(xì)胞分化最主要相關(guān)的3條通路如下：NF-κB信號(hào)通路、PI3k/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路。NF-κB通路在靜息狀態(tài)下，NF-κB的兩個(gè)亞單位p50/p65與IκB(NF-κB抑制蛋白)結(jié)合存在于細(xì)胞漿中。當(dāng)TRAF6識(shí)別RANKL后通過NF-κB 可誘導(dǎo)性激酶(NIK)和NF-κB 激酶誘導(dǎo)劑(IKK)活化NF-κB，使其兩個(gè)亞單位p50/p65與IκB分離并迅速轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化成熟或凋亡[12]。TRAF6識(shí)別RANKL后可激活c-Scr，進(jìn)而激活PI3k磷酸化AKT，來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞骨架重置、移動(dòng)并維持其存活[13-14]。MAPK信號(hào)通路：包括p38、JNK、ERK 3條支路，p38磷酸化通過活化下游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞骨吸收關(guān)鍵酶(如TRAP、CATK等)基因的表達(dá)促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化及骨吸收[15]；JNK磷酸化活化AP-1，誘導(dǎo)c-Fos表達(dá)來刺激破骨細(xì)胞前體分化成熟[16]；ERK磷酸化可以上調(diào)c-Fos的表達(dá)促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化[17-18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚可以明顯下調(diào)p65、AKT、p38、JNK、ERK的磷酸化水平，說明補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)破骨細(xì)胞抑制作用可能與抑制NF-κB信號(hào)通路、PI3k/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)破骨細(xì)胞的分化表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制作用，其作用機(jī)制與抑制NF-κB信號(hào)通路、PI3k/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路的激活相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚的進(jìn)一步開發(fā)利用及骨質(zhì)疏松癥的臨床治療提供參考。