陳賽楠 黃云梅 林燕萍 黃美雅

1.福建省中醫(yī)藥科學院骨質疏松證候基因組學重點研究室，福建 福州 350003 2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建 福州 350122 3.福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122

2014年Kusumbe等[1-2]學者首次發(fā)現(xiàn)小鼠長骨中存在特殊的毛細血管亞型：H型血管，其周圍富集大量Osterix+和Runx2+的骨祖細胞并且與骨形成密切相關，稱為“成血管-成骨偶聯(lián)”。研究顯示雙側卵巢切除術后小鼠骨量降低的同時伴隨H型血管和骨祖細胞數(shù)量顯著降低[3]，而促進H型血管新生可改善骨密度和顯微結構[4]，H型血管在絕經(jīng)后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)中的作用逐漸引起學者關注。

多種血管調(diào)控因子可直接或間接調(diào)控成血管-成骨偶聯(lián)，如神經(jīng)軸突導向分子3(Slit3)[5]和血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)[6]等，截短重組Slit3-LRRD2可緩解去卵巢小鼠骨量丟失[7]，然而PMOP骨組織中Slit3的表達變化及其上游miRNAs調(diào)控機制未見相關報道。microRNA是內(nèi)源性基因編碼的19-24nt單鏈非編碼RNA，與靶基因3′UTR堿基互補配結合引導靶基因降解或沉默，在PMOP的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用[8]。本研究通過觀察去卵巢快速骨丟失大鼠H型血管調(diào)控因子Slit3的表達變化，采用miRNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫篩選靶標miRNAs，雙熒光素酶報告基因驗證其直接作用，旨在初步探討Slit3的上游調(diào)控機制，為后續(xù)H型血管的深入研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級3月齡雌性SD大鼠20只，體重(180±20) g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，合格證編碼：20180004027331。實驗動物飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學院比較醫(yī)學中心，合格證號：醫(yī)動學第23-016號；通過動物倫理審查，編號：FJATCM-IAEC2021004，本次實驗前適應性喂養(yǎng)1周。

1.1.2細胞株和質粒：293 T人腎胚細胞(SunBio)、DH5a感受態(tài)細胞(Takara)、psiCHECK-2質粒(SunBio)、miR-148a-5p、miR-148b-5p、miR-410-3p、miR-129-5p、miR-374-5p、miRNA-NC過表達質粒(吉瑪基因)。

1.1.3主要試劑與儀器：通用SP檢測試劑盒(Solarbio)、EASYspin Plus骨組織RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物)、SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(AG11718)、Anti-Slit3 antibody(abcam, ab198726)、Anti-VEGFA antibody(abcam, ab231260)、Opti-MEM培養(yǎng)基(GIBCO)、胎牛血清(BI)、胰酶(Invitrogen)、PrimeSTAR、Taq酶、dNTP(Takara)、無縫克隆試劑盒(SunBio)、限制性內(nèi)切酶XhoI(NEB)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Takara)、小抽試劑盒(Promega)、Lipo2000 Transfection Reagent(Invitrogen)、Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)、Real-time PCR(ABI，7500 Fast)、全自動石蠟切片機(Leica，RM2255)、熒光倒置顯微鏡(Leica，DMI 4000B)、CO2培養(yǎng)箱(ESCO，CCL-240B-8)、酶標儀(Tecan，Infinite M1000)。

1.2 方法

1.2.1大鼠快速骨丟失模型制備：20只SD大鼠隨機分為假手術組和模型組，每組10只，采用雙側卵巢切除術制備模型，術前一日大鼠禁食不禁水，稱重，2%戊巴比妥鈉按照0.2 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉，腹部備皮，于腹部正中線作一長約1.5 cm的切口，打開腹腔沿子宮尋找雙側卵巢，結扎并摘除，逐層縫合；假手術組采用相同方法切除卵巢周邊等量的脂肪組織；術后3 d連續(xù)肌注青霉素8萬單位/d，預防感染。術后12周取脛骨和腰椎備檢。

1.2.2骨密度測量：去除脛骨周圍軟組織，生理鹽水沾濕紗布包裹并-20 ℃保存，復溫后固定掃描位置，雙能X線骨密度儀選用小動物高分辨掃描模式掃描脛骨，自選工具選定ROI區(qū)域，讀取骨密度。

1.2.3Real-timePCR檢測Slit3 mRNA表達：液氮研磨組織，骨組織RNA快速提取試劑盒提取總RNA，Nanodrop2000測其濃度，總RNA逆轉錄cDNA，-20 ℃保存；根據(jù)ncbi基因數(shù)據(jù)庫Sli3序列設計合成引物(表1)，采用SYBR Green 20 μL反應體系，反應條件為：95 ℃ 15 s，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s 40個循環(huán)，72 ℃ 5 min，β-actin作為內(nèi)參計算Slit3 mRNA的相對水平。

表1 Real-time引物序列Table.1 Primer sequences for real-time PCR

1.2.4免疫組織化學檢測Slit3和VEGFA表達：盡量去除脛骨周圍肌肉組織，4%多聚甲醛(pH 7.2～7.4)常溫固定72 h，10%EDTA(pH 7.2～7.4)常溫脫鈣，每3日換液至刀切無阻力感，樣本經(jīng)脫水、透明和浸蠟，石蠟包埋，選擇冠狀面為切面，4 μm厚切片，攤片，多聚賴氨酸防脫載玻片撈片和60 ℃拷片3 h；切片脫蠟至水，3%H2O2常溫10 min滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗滌3次，20 μg/mL蛋白酶K 37 ℃抗原修復，PBS洗滌3次，山羊血清37 ℃封閉20 min，1∶50 Slit3和1∶50 VEGFA一抗?jié)窈? ℃分別孵育過夜，PBS洗滌3次，1∶100羊抗小鼠/兔IgG 37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，1∶100鏈酶親和素-POD 37 ℃孵育30 min，PBS洗滌5次，DAB顯色，蘇木素復染，封片，200倍鏡下拍攝，每張切片選取12個不同視野，Image Pro Plus 6.0圖像半定量分析。

1.2.5預測靶向Slit3基因的miRNA：采用http://www.targetscan.org/vert_72/、http://mirdb.org/和http://www.mircode.org/index.php 3個miRNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫，輸入靶基因Slit3預測miRNA，選取數(shù)據(jù)庫交集用于后續(xù)實驗。

1.2.6構建雙熒光素酶報告基因載體：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/基因數(shù)據(jù)庫中檢索大鼠Slit3基因3′UTR序列NM_031 321.1，設計合成引物并引入相關酶切位點，擴增引物序列上游：5’-GTAATTCTAGGCGATCGCTCGAG-3′，下游：5’-GTTTAAACGAATTCCCGGG-3′；根據(jù)Slit3基因3′UTR序列與miR-148b-5p結合位點設計點突變合成突變體引物，上游：5’-ATAATAA AAACGCTGCAGA TTTTTTTGTTTATTTTACAATATAC-3′，下游：5’-ACAAAAAAATCTGCAGCGTTTTTATTATGG AAAGTGACTATTT-3′；PCR反應條件為98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min共30個循環(huán)，72 ℃ 10 min，擴增Slit3基因3′UTR野生型與突變型，擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠純化回收。限制性內(nèi)切酶XhoI對psiCHECK-2質粒載體進行酶切，回收6273bp載體片段；目的DNA片段和線性化載體以摩爾比2∶1同源重組入表達載體，同源重組載體轉化感受態(tài)細胞，Luria-Bertani平板挑取轉化子，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，轉化子保種并送測序，測序正確再接種抽提質粒，完成Slit3基因3′UTR野生型與突變型載體構建。

1.2.7細胞轉染：293 T細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，制備細胞懸液按30%～50%的匯合度接種于24孔板，實驗分為4組：miRNA-NC+Slit3-3′UTR WT、miR-148b-5p+Slit3-3′UTR WT、miRNA-NC+Slit3-3′UTR mut、和miR-148b-5p+Slit3-3′UTR mut，每組設置3個復孔，種板12 h后按照RNA∶DNA∶轉染試劑=50 nmol/L∶200 ng∶3 μL比例轉染質粒，轉染6 h后換液。

1.2.8熒光素酶活性檢測：293 T細胞質粒轉染48 h后吸除原培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，吸除PBS，配置1×PLB并恢復至室溫，每孔加入1×PLB 100 μL，搖床常溫15 min裂解細胞，反復吹吸后將24孔板置于冰上；采用白色不透光96孔板用于后續(xù)檢測，每孔加入預混合LAR II 20 μL，加入細胞裂解液上清1 μL，再加入水29 μL，靜置2 s酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶活性；立即再向每孔加入預混合Stop&Glo Reagent 20 μL，靜置2 s酶標儀檢測海腎熒光素酶活性；以螢火蟲熒光素酶為實驗報告基因，海腎熒光素酶為對照報告基因，兩者的比值顯示Slit3基因的激活程度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 脛骨骨密度

與假手術組[(0.414 8±0.009 8) g/mm2]相比，術后12周模型組脛骨近端骨密度[(0.317 7±0.015 7) g/mm2]顯著降低，降低約24.5%(P<0.001)，提示快速骨丟失模型制備成功。

2.2 Slit3 mRNA表達水平

與假手術組(1.000±0.000)相比，模型組骨組織中Slit3 mRNA表達水平(1.126 9±0.256)略有上調(diào)，但不具有統(tǒng)計學意義(P=0.682)。

2.3 Slit3和VEGFA表達情況

圖1A為Slit3的陰性對照，棕黃色即為陽性表達區(qū)域；顯微鏡下可見Slit3表達于骨小梁周邊的成骨細胞和血管內(nèi)皮細胞，定位細胞質；假手術組骺線下骨小梁數(shù)量多并且周徑長，然而Slit3表達強度較弱(圖1B)；模型組骨小梁稀疏并且髓腔內(nèi)脂肪細胞堆積，表達范圍較假手術組稍小(P=0.289)，然而平均光密度顯著增強(P=0.004)，其表達水平呈上調(diào)狀態(tài)(圖1C，表2)。VEGFA同為促血管生成因子，圖1 D為陰性對照，主要表達于骨細胞其周圍和血管內(nèi)皮細胞定位細胞質；與假手術組相比(圖1E)，模型組(圖1F)平均光密度稍高，然表達面積較低故累計光密度略小，但未達到統(tǒng)計學意義(表3)。

表2 兩組大鼠脛骨Slit3蛋白表達情況Table.2 Expression of Slit3 in the rats tibia

表3 兩組大鼠脛骨VEGFA蛋白表達情況Table.3 Expression of VEGFA in the rats tibia

2.4 Slit3基因與miRNAs的靶向關系預測

上述實驗結果顯示去卵巢大鼠骨量和血管生成情況均降低，H型血管調(diào)控因子Slit3表達顯著上調(diào)，表明Slit3在疾病中可能發(fā)揮重要作用，因此研究其上游調(diào)控miRNAs。targetscan、miRDB和miRcode數(shù)據(jù)庫預測大鼠Slit3基因與miRNAs的靶向關系，TargetScan預測到259個miRNAs，miRDB預測到15個miRNAs，miRcode預測到121個miRNAs；取數(shù)據(jù)庫交集并且評分高優(yōu)先，選擇最佳5個miRNAs：miR-148a-5p、miR-148b-5p、miR-410-3p、miR-129-5p和miR-374-5p。見圖2。

圖2 miRNAs生物信息學預測結果Fig.2 Results of bioinformatics prediction of miRNAs

2.5 重組雙熒光素酶報告基因載體構建

LB平板挑取轉化子，瓊脂糖凝膠電泳獲得592 bp的陽性克隆，DL2000 DNA Marker自上而下為2 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp和100 bp，與預期設計的目的片段長度相符(圖3A)?；驕y序綠色標記為載體序列，黃色標記為目的基因Slit3 3'UTR序列，藍色標記為點突變處，粉色標記為酶切位點，結果顯示目的基因序列無突變和缺失，表明重組雙熒光素酶報告基因載體構建成功(圖3B)，終載體圖譜見(圖3C)。

圖3 psiCHECK-2/Slit3-3′UTR mut和psiCHECK-2/Slit3-3′UTR WT質粒構建A：PCR鑒定候選轉化子；B：陽性克隆測序分析；C：質粒載體Fig.3 Construction of psiCHECK-2/Slit3-3′UTR mut and psiCHECK-2/Slit3-3′UTR WT plasmidA: The candidate transformants were identified by PCR; B: Positive clones were chosen for sequencing; C: Plasmid vector

2.6 雙熒光素酶報告基因檢測結果

上述5個miRNAs和psiCHECK-2-Slit3-3′UTR載體質粒共轉染293 T細胞，雙熒光素酶報告基因檢測其活性；與miRNA-NC對照組相比，miR-148b-5p熒光活性下調(diào)至68.91%(P=0)，miR-129-5p熒光活性下調(diào)至79.19%(P=0)，miR-148a-5p熒光活性下調(diào)至83.19%(P=0)，miR-410-3p熒光活性為92.56%，miR-374-5p熒光活性為114.99%；結果表明，miR-148b-5p對于slit3-3'UTR有一定的負調(diào)控作用，miR-148a-5p、miR-129-5p對其有微弱的負調(diào)控作用，miR-410-3p、miR-374-5p對其無明顯作用，因此選擇miR-148b-5p和slit3-3'UTR進行下一步實驗。見表4。

表4 熒光素酶活性比值Table.4 Results of ratio of luciferase activity

2.7 miR-148b-5p靶向調(diào)控Slit3基因表達

targetscan數(shù)據(jù)庫預測Slit3-3′UTR和miR-148b-5p存在潛在的結合位點(圖4A)，位于第147-154堿基AGAACTTA，將Slit3-3'UTR預測的結合位點點突變構建psiCHECK-2/Slit3-3′UTR mut質粒，與miR-148b-5p mimic共轉染293 T細胞。與miRNA-NC+Slit3-3′UTR WT相比，miR-148b-5p+Slit3-3′UTR WT熒光活性下調(diào)至72.24%(P=0)；與miRNA-NC+Slit3-3′UTR mut相比，miR-148b-5p+Slit3-3′UTR mut的熒光活性未見降低；結果表明miR-148b-5p特異性結合Slit3-3′UTR調(diào)控其表達水平(圖4B)。

圖4 Slit3-3′UTR點突變后雙熒光素酶活性比值A：Slit3-3′UTR與rno-miR-148b-5p結合位點預測；B：Slit3-3′UTR點突變后雙熒光素酶活性比值Fig.4 Ratio of dual luciferase activity after Slit3-3′UTR point mutationA: The prediction results of rno-miR-148b-5p binding sites in the Slit3-3′UTR; B: Ratio of double luciferase activity after Slit3-3′UTR point mutation

3 討論

Wang等[9]首次證實人體骨組織同樣存在H型血管，其數(shù)量與骨密度呈正相關。H型血管的表面標記物、分布和功能區(qū)別于其他毛細血管亞型，表面血小板內(nèi)皮細胞粘附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31)和內(nèi)皮粘蛋白(endomucin，Emcn)呈高表達，縱行排列交織成網(wǎng)主要分布于干骺端和骨內(nèi)膜，空間上其周邊骨祖細胞密布與骨形成緊密相關，時間上血管生成介導骨形成，這種時空上的緊密聯(lián)系稱“成血管-成骨偶聯(lián)”，將經(jīng)典骨重建二元調(diào)控理論豐富為“H型血管-成骨細胞-破骨細胞”三元調(diào)控理論。檢測絕經(jīng)后女性髖部骨折標本發(fā)現(xiàn)，H型血管數(shù)量隨骨密度降低而顯著降低[10]，并且血管面積大小與非絕經(jīng)后骨質疏松癥骨折患者間存在差異[11]，均與文獻報道動物實驗結果相符合[3]；腹腔注射去鐵胺(HIF-1α激活劑)可增強去卵巢小鼠H型血管形成從而改善骨密度和骨顯微結構[4]；因此有效調(diào)控H型血管或將成為PMOP治療的新方向。

1984年，Nüsslein-Volhard等[12]學者發(fā)現(xiàn)神經(jīng)軸突導向分子家族(SLIT guidance ligand，Slit)，最早作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制因子被發(fā)現(xiàn)，是高度保守的大分子分泌型糖蛋白，與靶細胞膜上的單次跨膜受體蛋白ROBO(Roundabout)家族相結合，調(diào)控神經(jīng)軸突的定向生長以阻止中線交叉[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)Slit3是新型有效的促血管生成因子[14]，在骨組織等非神經(jīng)系統(tǒng)中同樣起重要作用，Slit3的rs10036727單核苷酸多態(tài)性與絕經(jīng)后婦女股骨頸骨密度顯著相關[15]；Slit3OSX小鼠出現(xiàn)H型血管數(shù)量減少和骨量降低；采用Slit3重組蛋白干預去卵巢小鼠，提高H型血管數(shù)量以上調(diào)骨密度[5]。本研究結果顯示，去卵巢大鼠骨密度和血管生成情況降低，組織Slit3 mRNA表達水平略升高和蛋白表達水平顯著升高；其可能原因是Slit3與H型血管密切相關，PMOP為高轉換型骨質疏松癥，破骨細胞和成骨細胞均過度活躍，導致其Slit3表達水平上調(diào)。結合文獻報道均表明Slit3是調(diào)控成血管-成骨偶聯(lián)的關鍵因子之一，可能成為POMP診斷和治療的新靶點，進一步探討其上游潛在的miRNA調(diào)控機制勢在必行。

miRNAs是內(nèi)源基因編碼的19-24nt非編碼單鏈RNA，初級轉錄產(chǎn)物pri-miRNA經(jīng)剪切后成miRNA前體pre-miRNA，再轉運至胞漿經(jīng)Dicer酶切成成熟miRNA，與靶基因3′UTR堿基配對結合，依賴RISC降低靶基因穩(wěn)定性引導降解或抑制表達，在PMOP病程中起重要調(diào)控作用。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)去卵巢小鼠外泌體中miR-214-3p表達水平增高，過表達miR-214-3p出現(xiàn)H型血管新生減少和小管形成數(shù)量降低。Lin等[16]發(fā)現(xiàn)miR-338靶向Runx2/Sox4/調(diào)控成骨細胞分化，PMOP患者和OVX小鼠血清中miR-338表達水平均顯著增高，并且注射miR-338抑制劑可顯著預防卵巢切除導致的快速骨丟失。近年來miR-148b-5p的生物學功能研究逐漸增加，miR-148b-5p可通過靶向負調(diào)控CALR表達以調(diào)節(jié)雪旺細胞的增殖和遷移，可能是周圍神經(jīng)損傷治療的新靶點[17]；胃癌(gastric cancer，GC)患者miR-148b-5p表達顯著下調(diào)，過表達miR-148b-5p在體內(nèi)外均可顯著抑制GC細胞增殖和侵襲，靶向ATPIF1直接抑制免疫微環(huán)境和胃癌進展[18]。

本研究結果顯示，miR-148b-5p通過靶向結合Slit3-3'UTR調(diào)控H型血管關鍵調(diào)控因子Slit3表達，可能參與成血管-成骨偶聯(lián)的調(diào)控，可能是PMOP發(fā)生發(fā)展的分子機制之一。綜上所述，本研究初步探討miR-148b-5p和Slit3的作用機制，后續(xù)將進一步研究PMOP中miR-148b-5p的差異表達，并通過gain-of-function和loss-of-function觀察其調(diào)控H型血管表型的變化，以成血管-成骨偶聯(lián)切入點深入闡釋PMOP的病理機制，為疾病的診斷和治療提供新思路和方向。