王雪,宓曉晴,宋寧

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是一種緩慢進(jìn)展的神經(jīng)退行性疾病，以運(yùn)動(dòng)障礙、肌僵直、靜止性震顫及姿勢(shì)反射障礙等為特征性表現(xiàn)，其主要病理學(xué)特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的丟失以及紋狀體多巴胺釋放減少[1-5]。PD病因涉及遺傳、環(huán)境和衰老等多種因素，但確切病因尚不完全清楚[6]。α-突觸核蛋白(α-Syn)聚集體構(gòu)成的路易小體廣泛存在于PD受損的多巴胺能神經(jīng)元中，被認(rèn)為是PD發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素。α-Syn是由140個(gè)氨基酸組成的蛋白，以分子伴侶的形式參與多項(xiàng)生理功能，但其聚集體會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)等[7-10]。鐵是人體必需的微量元素之一，其缺乏會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但過(guò)量的鐵也具有細(xì)胞毒性[11-16]。鐵會(huì)隨著年齡的增加沉積于黑質(zhì)等腦區(qū)，但是這種現(xiàn)象在PD中尤為嚴(yán)重。細(xì)胞內(nèi)的鐵通過(guò)ferroportin(FPN)從細(xì)胞中轉(zhuǎn)出。FPN是一種跨膜的鐵轉(zhuǎn)出蛋白，是目前唯一已知的細(xì)胞內(nèi)鐵釋放的通路，主要受鐵調(diào)節(jié)蛋白和鐵調(diào)素調(diào)節(jié)[17]。近年來(lái)大量研究表明，細(xì)胞內(nèi)鐵沉積和α-Syn聚集存在緊密的相互作用，共同參與多巴胺能神經(jīng)元損傷，并可能導(dǎo)致PD病理的惡性循環(huán)[18]。α-Syn調(diào)控鐵代謝的機(jī)制尚未闡明，本實(shí)驗(yàn)旨在探究α-Syn高表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞FPN、鐵調(diào)節(jié)蛋白1(IRP1)蛋白表達(dá)和鐵調(diào)素mRNA水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及主要試劑

PC12細(xì)胞由英國(guó)劍橋醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)遺傳系David C. Rubinsztein教授饋贈(zèng)。該細(xì)胞攜帶人源野生型(WT)α-Syn基因，在NheⅠ/SalⅠ位點(diǎn)將該基因插入pTRE2hyg載體，并在該載體中插入調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)的多西環(huán)素(DOX)開(kāi)關(guān)。DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清和馬血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，DOX購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；α-Syn抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司，F(xiàn)PN抗體購(gòu)于以色列Alomonelabs公司，IRP1抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，兔抗β-actin購(gòu)于中國(guó)博奧森公司，羊抗兔IgG購(gòu)于中國(guó)愛(ài)必信公司；TRIzol和PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司，SYBR Green購(gòu)于美國(guó)QIAGEN公司，鐵調(diào)素引物購(gòu)于中國(guó)Takara公司。

1.2 細(xì)胞分組與處理

將PC12細(xì)胞用完全培養(yǎng)液(DMEM高糖培養(yǎng)液168.9 mL、胎牛血清10.0 mL、馬血清20.0 mL、潮霉素B 0.3 mL、G418 0.8 mL)重懸后，以3×108/L的密度接種于6孔板內(nèi)，每孔2 mL，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%左右時(shí)將其分為對(duì)照組和DOX處理組，分別用基礎(chǔ)培養(yǎng)液(DMEM高糖培養(yǎng)液)和2 mg/L的DOX處理24 h。共進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3 免疫印跡法檢測(cè)α-Syn、FPN和IRP1蛋白的表達(dá)

藥物處理24 h后，使用RIPA裂解液提取蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒檢測(cè)提取蛋白的濃度，按照每孔20 μg計(jì)算上樣量，加入Loading Buffer，95 ℃加熱蛋白5 min，將蛋白樣本進(jìn)行電泳(電壓為80 V和120 V)，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PDVF膜上(電流為300 mA)。用50 g/L的牛血清清蛋白封閉2 h后分別加入α-Syn、FPN、IRP1、β-actin一抗，于4 ℃搖床上孵育過(guò)夜。用TBST洗30 min后加入二抗室溫孵育1 h，以TBST洗30 min后應(yīng)用ECL發(fā)光液顯影。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行分析，α-Syn、FPN和IRP1蛋白表達(dá)水平以三者與β-actin灰度值之比來(lái)表示。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鐵調(diào)素mRNA表達(dá)

每1 mL TRIzol試劑裂解的樣品中加入0.2 mL的氯仿室溫孵育2～3 min，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min。取上層水相并加入異丙醇，以上述同樣條件離心10 min，用體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇清洗后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green染料法定量檢測(cè)基因的表達(dá)。按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR體系循環(huán)擴(kuò)增，使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參照基因GAPDH的表達(dá)量。PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 DOX對(duì)PC12細(xì)胞α-Syn表達(dá)的影響

對(duì)照組和DOX處理組細(xì)胞內(nèi)α-Syn蛋白表達(dá)水平分別為1.001±0.331和2.851±0.137(n=6)，DOX處理組α-Syn蛋白表達(dá)水平是對(duì)照組的2.85倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.245，P<0.05)。

2.2 α-Syn 高表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞FPN和IRP1蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組和DOX處理組細(xì)胞內(nèi)FPN蛋白表達(dá)水平分別為1.000±0.032和0.993±0.063(n=6)，IRP1蛋白表達(dá)水平分別為0.998±0.107和0.965±0.042(n=6)，DOX處理組細(xì)胞內(nèi)FPN蛋白表達(dá)水平是對(duì)照組的99.3%，IRP1蛋白表達(dá)水平是對(duì)照組的96.9%，DOX處理組FPN和IRP1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較沒(méi)有明顯變化，差異無(wú)顯著意義(t=0.092、0.268，P>0.05)。

2.3 α-Syn高表達(dá)對(duì)PC12細(xì)胞鐵調(diào)素mRNA水平的影響

對(duì)照組和DOX處理組細(xì)胞內(nèi)鐵調(diào)素mRNA表達(dá)水平分別為1.003±0.044和1.365±0.069(n=5)，DOX處理組鐵調(diào)素mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高36.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.162，P<0.05)。

3 討 論

鐵是維持神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能所必需的微量元素之一。然而，在PD病人的黑質(zhì)致密部觀察到鐵特異性地沉積，部分多巴胺能神經(jīng)元觀察到鐵水平升高[17,19]。在生理?xiàng)l件下，鐵參與了多巴胺的合成；然而，過(guò)量的鐵誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(ROS)，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的不可逆損傷[20]。在黑質(zhì)致密帶幸存的多巴胺能神經(jīng)元的路易小體中，鐵染色最為明顯，證明鐵與α-Syn的大量共同存在，提示鐵沉積和α-Syn聚集密切相關(guān)[21]。已有文獻(xiàn)報(bào)道了α-Syn對(duì)鐵代謝的影響，例如α-Syn可以結(jié)合三價(jià)鐵和二價(jià)鐵形成α-Syn-鐵絡(luò)合物[22]。此外，α-Syn具有鐵還原酶的作用，可催化三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵，過(guò)量的α-Syn導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵水平增加和三價(jià)鐵、二價(jià)鐵的比例失調(diào)[23]。最近有研究表明，在高表達(dá)α-Syn的SH-SY5Y細(xì)胞和A53Tα-Syn轉(zhuǎn)基因小鼠中，α-Syn可以上調(diào)鐵轉(zhuǎn)入蛋白二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(DMT1)的表達(dá)且不依賴(lài)鐵反應(yīng)元件(IRE)/IRP1系統(tǒng)，可能與泛素-蛋白酶體的降解異常有關(guān)，這可能導(dǎo)致了α-Syn高表達(dá)時(shí)細(xì)胞內(nèi)鐵沉積[24]。目前，α-Syn對(duì)鐵轉(zhuǎn)出蛋白FPN的表達(dá)影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察到，PC12細(xì)胞α-Syn高表達(dá)時(shí)其FPN表達(dá)沒(méi)有發(fā)生明顯變化，說(shuō)明α-Syn高表達(dá)時(shí)出現(xiàn)的泛素-蛋白酶體降解異常并不足以調(diào)控FPN表達(dá)變化。

FPN的表達(dá)主要受到鐵調(diào)節(jié)蛋白和鐵調(diào)素的調(diào)控。FPNmRNA 5′端非編碼區(qū)含有一個(gè)IRE，在細(xì)胞內(nèi)高鐵的情況下，IRE與鐵調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合減少，因此對(duì)FPNmRNA翻譯的抑制減弱，導(dǎo)致FPN蛋白表達(dá)增多[25-26]。與鐵調(diào)節(jié)蛋白2(IRP2)相比，IRP1與IRE的親和力更高[27]。本文研究結(jié)果顯示，PC12細(xì)胞內(nèi)α-Syn高表達(dá)對(duì)FPN和IRP1蛋白的表達(dá)均沒(méi)有明顯影響。我們推測(cè)，在α-Syn高表達(dá)的細(xì)胞中，雖然文獻(xiàn)報(bào)道DMT1表達(dá)上調(diào)，但細(xì)胞外液中鐵水平較低，并沒(méi)有造成細(xì)胞內(nèi)鐵沉積，因此也不會(huì)導(dǎo)致IRP1和FPN的表達(dá)變化。

鐵調(diào)素是一種由肝臟合成和分泌的小多肽，被認(rèn)為是人體鐵穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)者。鐵調(diào)素通過(guò)與細(xì)胞膜上的鐵轉(zhuǎn)出蛋白FPN結(jié)合誘導(dǎo)其泛素化從而導(dǎo)致FPN內(nèi)化和降解，以此來(lái)控制FPN在膜上的表達(dá)和細(xì)胞的鐵釋放[28-29]。本研究結(jié)果顯示，高表達(dá)α-Syn的PC12細(xì)胞中鐵調(diào)素mRNA水平上調(diào)。有文獻(xiàn)報(bào)道，α-Syn可激活核因子κB(NF-κB)信號(hào)傳導(dǎo)通路釋放白細(xì)胞介素6，后者可以通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活促進(jìn)鐵調(diào)素的轉(zhuǎn)錄[30-31]。因此我們推測(cè)，鐵調(diào)素表達(dá)上調(diào)與細(xì)胞內(nèi)α-Syn蓄積有關(guān)，但具體機(jī)制需進(jìn)一步證實(shí)。雖然鐵調(diào)素表達(dá)上調(diào)，但本實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有觀察到FPN的表達(dá)變化，這與鐵調(diào)素的作用具有組織細(xì)胞特異性的報(bào)道相一致，例如在腸細(xì)胞中，鐵調(diào)素不會(huì)改變FPN水平但會(huì)降低DMT1的表達(dá)[24,32-33]。由于鐵調(diào)素分子量只有9 000，很難用常規(guī)免疫印跡方法檢測(cè)其蛋白水平，因此其蛋白水平是否發(fā)生變化尚無(wú)法確定。此外，DOX處理誘導(dǎo)α-Syn過(guò)表達(dá)雖然引起了鐵調(diào)素mRNA表達(dá)水平上調(diào)，但其時(shí)間(只有24 h)和表達(dá)量(約1.5倍)可能并不足以造成α-Syn異常聚集和調(diào)控FPN表達(dá)變化。

綜上所述，在PC12細(xì)胞中，高表達(dá)α-Syn 24 h對(duì)鐵轉(zhuǎn)出蛋白FPN和鐵調(diào)節(jié)蛋白IRP1表達(dá)均無(wú)明顯影響，但可顯著上調(diào)鐵調(diào)素的表達(dá)水平。本文結(jié)果為α-Syn調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鐵代謝提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。