馬月,陳蕾蕾,謝俊霞

(青島大學基礎醫(yī)學院生理學與病理生理學系,山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是發(fā)病率較高的神經(jīng)退行性疾病之一，其確切病因尚未完全闡明。研究證實，腦鐵代謝異常與α-突觸核蛋白的異常聚集在PD發(fā)病及進程中起著重要作用，而溶酶體是細胞內(nèi)重要的儲鐵細胞器以及降解α-突觸核蛋白的主要場所，因此，溶酶體及自噬功能與PD發(fā)病密切相關[1-4]。轉錄因子EB(TFEB)是維持細胞自噬穩(wěn)定的轉錄因子[5]。大量PD細胞與動物模型實驗均證實TFEB在神經(jīng)退行性疾病中具有保護作用，提示TFEB可成為治療或改善PD并提供神經(jīng)保護作用的有效靶點[6-8]。雖然TFEB在神經(jīng)退行性疾病中的保護作用研究由來已久，但是以往研究主要側重于TFEB增強或改善自噬功能、清除α-突觸核蛋白等方面，對于TFEB在PD鐵死亡中的作用研究目前少見。本實驗在PC12細胞上高表達TFEB，并給予鐵死亡誘導劑Erastin進行處理，觀察光鏡下細胞的生長狀態(tài)并檢測鐵死亡重要調(diào)節(jié)因子谷胱甘肽過氧化酶4(GPX4)及鐵蛋白輕鏈(FTL)的表達水平，從鐵代謝的角度探究TFEB在對抗鐵死亡、保護神經(jīng)細胞中的可能作用，從而為PD治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

所用PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自Hyclone公司；opti-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、馬血清、瞬時過表達轉染試劑LipofectamineTM3000購自Thermo Fisher公司；PBS緩沖液、青霉素-鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司；Erastin購自Sigma公司；ECL發(fā)光液購自Millipore公司；GPX4抗體和FTL抗體購自abcam公司；TFEB抗體購自Proteintech公司；β-actin抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；羊抗兔二抗購自愛必信(上海)生物科技有限公司；空載體質(zhì)粒與過表達TFEB質(zhì)粒購自廣州銳博生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀公司。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組及處理 ①預實驗：PC12細胞鋪板24 h后分別采用空載體質(zhì)粒和1、3、5、7 nmol/L濃度的過表達TFEB質(zhì)粒轉染細胞，轉染24 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并在光鏡下觀察細胞生長狀態(tài)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h(即轉染48 h)后收集細胞并提取蛋白，采用免疫印跡法檢測TFEB蛋白表達水平，以確定最適轉染條件。當采用濃度為5 nmol/L的過表達TFEB質(zhì)粒轉染細胞時，TFEB蛋白表達水平上調(diào)最為明顯，且光鏡下觀察細胞生長狀態(tài)較好，因此選取該濃度作為后續(xù)實驗中過表達TFEB質(zhì)粒轉染PC12細胞的轉染濃度。②細胞轉染及藥物處理：實驗分為空載體組、高表達TFEB組、空載體+Erastin組、高表達TFEB+Erastin組。PC12細胞鋪板培養(yǎng)24 h后采用空載體質(zhì)?；蛘? nmol/L的過表達TFEB質(zhì)粒轉染細胞，轉染細胞24 h后，給予或者不給予鐵死亡誘導劑Erastin(10 μmol/L)繼續(xù)處理24 h。

1.2.2光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)學特征 細胞經(jīng)藥物處理后，在倒置顯微鏡(OLYMPUS IX73)明場模式下，采用10×10倍的放大倍數(shù)觀察并獲取10個不同視野的圖像，隨機選取3個視野的圖像進行分析，記錄細胞形態(tài)學特征和該視野中具備細胞形態(tài)的細胞數(shù)目。

1.2.3免疫印跡法檢測FTL和GPX4蛋白表達將藥物處理后的細胞用預冷的PBS漂洗1次，去除PBS后按5×105個細胞加50 μL裂解液(RIPA)的比例加入細胞裂解液，使用細胞刮收集各組細胞，置于冰上裂解30 min，在4 ℃下以12 000 r/min離心30 min，收集上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后100 ℃金屬浴5 min使蛋白變性。配制SDS-PAGE凝膠，進行電泳(恒壓80 V)、轉膜(恒流300 mA，90 min)。轉膜結束后將印有蛋白的PVDF膜置于50 g/L脫脂奶粉封閉液中，室溫孵育2 h。封閉完成以后洗去封閉液，加入FTL(1∶1 000)、GPX4(1∶10 000)、β-actin(1∶10 000)、TFEB(1∶1 000)一抗，放至4 ℃恒溫搖床孵育過夜。去除一抗后用TBST洗膜3次，每次10 min。加山羊抗兔(1∶10 000)的HRP-IgG二抗室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。將膜用發(fā)光液避光孵育1 min，采用美國UVP凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。用Image J軟件分析條帶灰度值，結果以目的蛋白(GPX4、FTL)與內(nèi)參照蛋白(β-actin)灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 高表達TFEB對Erastin誘導鐵死亡細胞形態(tài)學特征的影響

空載體組、高表達TFEB組細胞生長狀態(tài)良好，呈多角形和梭形，細胞伸展，可見粗大的突起，折光性好。空載體+Erastin組出現(xiàn)輕微細胞毒性與生長抑制現(xiàn)象，細胞數(shù)目較少，小部分細胞折光性變差，細胞變圓，突起回縮，表面可見泡狀小體，細胞輪廓界限模糊。與空載體+Erastin組細胞相比較，高表達TFEB+Erastin組細胞較為伸展，突起輕微回縮，細胞出現(xiàn)輕微生長抑制現(xiàn)象。

空載體組、高表達TFEB組、空載體+Erastin組、高表達TFEB+Erastin組的細胞數(shù)目分別為288.00±29.48、229.30±19.64、89.00±5.00、175.30±2.91(n=3)。與空載體組相比較，空載體+Erastin組細胞損傷明顯，存活的細胞數(shù)目少；與空載體+Erastin組相比，高表達TFEB+Erastin組細胞生長狀態(tài)較好，存活的細胞數(shù)目多，差異有統(tǒng)計學意義(F=22.2，P<0.05)。

2.2 高表達TFEB對細胞內(nèi)GPX4及FTL蛋白表達的影響

空載體組與高表達TFEB組細胞內(nèi)的GPX4蛋白表達水平分別為1.200±0.217、1.667±0.165(n=7)，與空載體組相比，高表達TFEB組細胞內(nèi)GPX4蛋白表達水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.194，P<0.05)?？蛰d體組與高表達TFEB組細胞內(nèi)FTL蛋白表達水平分別為0.872±0.106、1.631±0.150(n=3)，與空載體組相比較，高表達TFEB組細胞內(nèi)FTL蛋白表達水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.127，P<0.05)。

3 討 論

近年來，在對PD病因及機制的探索中逐漸證實，除蛋白質(zhì)異常聚集、線粒體功能障礙、氧化應激、炎癥反應等因素與PD發(fā)病密切相關外，黑質(zhì)區(qū)鐵異常沉積這一病理改變也參與PD的發(fā)生發(fā)展[9-13]。鐵是維持生物體基本生理功能的重要元素，隨著年齡增加，鐵會在腦中聚集，而這種聚集會在神經(jīng)退行性疾病尤其是PD中加劇[14-15]。在PD中，過量的鐵會形成羥自由基，進而誘導氧化應激，增強多巴胺衍生的代謝毒性，并通過促進α-突觸核蛋白表達和聚集而加劇多巴胺能神經(jīng)元退變[16-18]。鐵死亡是一種依賴于鐵的非凋亡性的細胞死亡方式，在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導的PD小鼠模型和過表達α-突觸核蛋白的轉基因小鼠模型中均發(fā)現(xiàn)了鐵死亡現(xiàn)象，而且鐵死亡抑制劑ferrostatin-1可以顯著抑制魚藤酮對多巴胺能神經(jīng)元的毒性[19-20]。這些研究均提示，鐵死亡參與了PD多巴胺能神經(jīng)元退變過程，抑制鐵死亡很有可能成為保護多巴胺能神經(jīng)元、干預PD的有效策略之一。

雖然TFEB在PD中的保護作用已被大量研究證實，但是以往的研究主要側重于TFEB激活或改善自噬功能、清除α-突觸核蛋白方面，對于TFEB在PD鐵死亡中的作用研究較少。最近有文獻報道，羧基修飾的聚苯乙烯納米顆粒可以通過促進TFEB核轉位、增強細胞內(nèi)超氧化物歧化酶表達、降低活性氧水平、抑制脂質(zhì)過氧化來抑制鐵死亡[21]。然而，TFEB是否還可以通過其他途徑抑制鐵死亡，以及其與PD中鐵死亡發(fā)生的關系目前尚不清楚。

鐵死亡的標志蛋白GPX4是一種內(nèi)源性的膜脂修復酶，在其催化下，谷胱甘肽可將具有潛在毒性的過氧化脂類還原為無毒的脂醇，從而阻止鐵死亡的發(fā)生，而當鐵死亡發(fā)生時GPX4的表達降低[22]。PC12細胞來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻細胞瘤，當神經(jīng)生長因子(NGF)存在時，可以分化為交感神經(jīng)元[23-24]。PC12細胞可以合成和儲存多巴胺，因此也被廣泛用作神經(jīng)退行性疾病的細胞模型[25]。本實驗中，當在PC12細胞上高表達TFEB時，GPX4蛋白表達水平明顯上調(diào)，從功能的角度直接驗證了TFEB對抗鐵死亡、保護細胞的作用。Erastin是一種常用的鐵死亡誘導劑[26]，本實驗中給予Erastin(10 μmol/L)處理細胞24 h，并通過光學顯微鏡觀察各組細胞的生長狀態(tài)。本文研究結果表明，高表達TFEB可降低Erastin誘導的細胞毒性，保護細胞免受鐵死亡的影響。另一方面，鐵死亡發(fā)生時會誘導鐵自噬，即鐵蛋白的降解，從而釋放鐵、增加細胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池，進而增加細胞氧化水平[27]。鐵蛋白是機體用來儲存鐵的主要蛋白質(zhì)。鐵蛋白由FTL和鐵蛋白重鏈(FTH)組成，其中，F(xiàn)TH具有亞鐵氧化酶的活性，負責鐵的吸收，而FTL負責鐵的儲存。鐵蛋白的降解會導致鐵的釋放從而導致氧化損傷[28]，抑制鐵蛋白降解可以抑制Erastin誘導的鐵沉積、脂質(zhì)過氧化以及鐵死亡發(fā)生[29]。本文實驗結果表明，PC12細胞高表達TFEB后，F(xiàn)TL水平明顯升高，提示高表達TFEB可以增強細胞儲鐵能力，從而降低胞漿內(nèi)游離的氧化還原活性鐵，減少氧化應激，從這一角度也可證實TFEB對鐵死亡的抑制作用。

綜上所述，在PC12細胞上高表達TFEB，可降低鐵死亡誘導劑Erastin的毒性作用。同時，高表達TFEB可上調(diào)FTL與GPX4蛋白表達水平，提示TFEB可能通過增加細胞鐵儲存、降低細胞內(nèi)游離鐵水平，抑制鐵死亡，保護神經(jīng)細胞。本實驗初步從鐵代謝的角度探討了TFEB的神經(jīng)保護作用，為防治PD提供了新思路。然而，TFEB是通過何種途徑調(diào)節(jié)鐵代謝，以及通過何種途徑抑制鐵死亡、保護神經(jīng)元目前尚未可知，仍需進一步研究探討其具體作用機制。