石 艷，李 灣，李 超,2，李夢(mèng)妍，王 慧，劉文穎，馬遇慶

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是我國最常見的食管癌組織學(xué)類型，男性發(fā)病率明顯高于女性，且預(yù)后較差[1]。本課題組前期一直致力于腫瘤干細(xì)胞因子SOX家族基因在ESCC中的作用機(jī)制研究[2]。SOX17是轉(zhuǎn)錄因子SOX家族[3]的成員，有研究表明，SOX17可以抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移基因1(metastasis associated in colon cancer 1, MACC1)、FN1等基因，從而抑制ESCC的進(jìn)展[4]。MACC1可以激活HGF/c-Met信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[5]。本文擬采用免疫組化SP法檢測SOX17、MACC1和c-Met在ESCC中的表達(dá)，并分析三者之間的相關(guān)性及對(duì)患者預(yù)后的影響，以期為ESCC治療提供更充分的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2008年1月～2018年6月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院存檔的232例ESCC及其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織石蠟標(biāo)本，制成組織芯片。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有ESCC患者術(shù)前未行放、化療，均為漢族和哈薩克族人。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 免疫組化采用免疫組化SP法進(jìn)行檢測：將組織切片放入烤箱65 ℃ 45 min，以軟化石蠟涂層。置于二甲苯中脫蠟，100%、95%、80%和70%梯度乙醇脫水；枸櫞酸緩沖液(pH 6.4)微波爐高溫修復(fù)15 min，自然冷卻。過氧化氫封閉10 min；1%山羊血清阻斷，滴加一抗SOX17(bs-12205R，1∶300)、MACC1(bs-4293R，1∶100)、c-Met(bs-0668R，1∶300)，37 ℃孵育90 min。PBS洗滌后，添加二抗(山羊抗兔IgG)孵育15 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染20 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3 結(jié)果判定SOX17結(jié)果判定根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分：SOX17陽性定位于腫瘤細(xì)胞核和胞質(zhì)。(1)按腫瘤陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：≤1%為0分，1%～33%為1分，34%～66%為2分，≥67%為3分；(2)按細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分；將兩項(xiàng)評(píng)分相乘作為最終評(píng)分：0～2分為陰性，3分為陽性[4]。MACC1和c-Met結(jié)果判讀：MACC1陽性定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)和胞膜，c-Met陽性定位于胞質(zhì)和胞核。(1)按腫瘤陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～100%為3分；(2)按細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；將兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相乘作為最終評(píng)分：0～4分為陰性，5～9分為陽性[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)、Kaplan-Meier法和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征ESCC患者年齡32～83歲，中位年齡64歲；腫瘤中位直徑3.2 cm(0.5～7.5 cm)；男性165例，女性67例；漢族118例，哈薩克族114例。分化程度：高分化61例，中分化123例，低分化48例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：陰性159例，陽性73例；浸潤深度：黏膜層7例，肌層98例，全層127例。AJCC分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期146例，Ⅲ期45例，Ⅳ期22例。脈管侵犯：陰性190例，陽性42例。神經(jīng)侵犯：陰性182例，陽性50例。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移：陰性201例，陽性31例。

2.2 ESCC中SOX17、MACC1和c-Met蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系正常食管黏膜中SOX17的陽性率為73.3%(170/232)，而MACC1與c-Met均陰性。ESCC組織中SOX17的陽性率為18.1%(42/232)，MACC1為57.3%(133/232)，c-Met為54.3%(126/232)(圖1)。Pearson χ2分析三者表達(dá)與ESCC臨床病理特征的關(guān)系(表1)：SOX17表達(dá)與脈管侵犯(P=0.017)、神經(jīng)侵犯(P=0.014)相關(guān)(P<0.05)；MACC1表達(dá)與腫瘤直徑(P=0.039)、AJCC分期(P=0.020)相關(guān)；c-Met表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.045)。

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌中SOX17、MACC1、c-Met表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

圖1 A.食管鱗狀細(xì)胞癌中SOX17呈陰性，SP法；B.食管鱗狀細(xì)胞癌中MACC1呈陽性，SP法；C.食管鱗狀細(xì)胞癌中c-Met呈陽性，SP法；D.正常食管組織中SOX17呈陽性，SP法；E.正常食管組織中MACC1呈陰性，SP法；F.正常食管組織中c-Met呈陰性，SP法

2.3 ESCC中SOX17、MACC1與c-Met三者間表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析(表2)：SOX17表達(dá)與MACC1(P=0.750)及c-Met表達(dá)無關(guān)(P=0.948)；MACC1表達(dá)與c-Met表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.398，P<0.001)。GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn)相關(guān)性分析顯示，MACC1表達(dá)與c-Met表達(dá)(r=0.398，P<0.001)呈正相關(guān)。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌中SOX17、MACC1和c-Met表達(dá)的相關(guān)性[n(%)]

2.4 SOX17、MACC1、c-Met表達(dá)對(duì)ESCC患者預(yù)后的影響 232例ESCC患者的總生存率為34.5%。Log-rank單因素分析顯示：患者年齡(P=0.020)、分化程度(P=0.009)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.003)、AJCC分期(P=0.001)、神經(jīng)侵犯(P=0.008)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.026)與ESCC患者的總生存期(overall survival, OS)相關(guān)；患者年齡(P=0.016)、分化程度(P=0.005)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)、AJCC分期(P<0.001)、神經(jīng)侵犯(P=0.021)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.002)與無進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析：SOX17表達(dá)與OS(P=0.626)和PFS(P=0.477)均無關(guān)。MACC1表達(dá)與OS(P=0.905)和PFS(P=0.778)均無關(guān)。c-Met表達(dá)與ESCC患者的OS相關(guān)(P=0.021)，提示c-Met陽性患者的OS縮短，而與PFS無關(guān)(P=0.052，表3)。

表3 食管鱗狀細(xì)胞癌患者OS和PFS的單因素分析

各單因素分析顯著變量的Cox多因素比例分析：患者年齡(P=0.023)、分化程度(P=0.003)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.004)、AJCC分期(P=0.001)、神經(jīng)侵犯(P=0.01)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.03)、c-Met表達(dá)(P=0.025)與OS相關(guān)，是患者OS不良的獨(dú)立預(yù)后因素?；颊吣挲g(P=0.019)、分化程度(P=0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)、AJCC分期(P<0.001)、神經(jīng)侵犯(P=0.024)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.003)是影響PFS的獨(dú)立因素，而c-Met表達(dá)(P=0.057)與患者PFS無關(guān)(表4)。

表4 食管鱗狀細(xì)胞癌患者OS和PFS的多因素分析

3 討論

SOX17是轉(zhuǎn)錄因子SOX家族成員，其在食管癌[7]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[8]、胃癌[9]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[10]、腎透明細(xì)胞癌[11]等多種腫瘤中均低表達(dá)，在抑制腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮作用。Jia等[12]發(fā)現(xiàn)ESCC中SOX17外顯子區(qū)域發(fā)生甲基化，SOX17甲基化后誘導(dǎo)β-catenin表達(dá)上調(diào)和重新分布，繼而異常激活下游通路，促進(jìn)食管腫瘤的進(jìn)展。Kuo等[4]發(fā)現(xiàn)，SOX17通過抑制MACC1、FN1等靶基因的表達(dá)抑制ESCC的遷移和侵襲；當(dāng)SOX17低表達(dá)時(shí)，ESCC患者TNM分期更高、更易復(fù)發(fā)且其生存率顯著較低。本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，81.9%的ESCC患者中SOX17低表達(dá)；SOX17低表達(dá)與發(fā)生血管侵犯(P=0.017)和神經(jīng)侵犯(P=0.014)有關(guān)，但SOX17表達(dá)與MACC1(P=0.750)和c-Met表達(dá)(P=0.948)均不相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)：SOX17表達(dá)與ESCC患者生存時(shí)間無顯著相關(guān)性(OS：P=0.626，PFS：P=0.477)。上述結(jié)果的差異可能與受試者的個(gè)體差異和樣本量有關(guān)。

2008年Stein等[13]首次發(fā)現(xiàn)MACC1，近期有文獻(xiàn)報(bào)道MACC1在胃癌中高表達(dá)，MACC1與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)[14]。MACC1可以通過調(diào)節(jié)c-Met/Cyclin D1軸促進(jìn)ESCC進(jìn)展[15]。Zhu等[16]發(fā)現(xiàn)與正常食管鱗狀上皮相比，MACC1在ESCC中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)(P<0.05)，MACC1高表達(dá)是ESCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素。本組ESCC患者中MACC1陽性率為57.3%；MACC1陽性與腫瘤直徑≥3 cm(P=0.039)、AJCC分期高(P=0.020)相關(guān)。此外，生存分析顯示：MACC1表達(dá)與ESCC患者預(yù)后無明顯影響(OS：P=0.905，PFS：P=0.778)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：MACC1表達(dá)與c-Met表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.398，P<0.001)。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示：MACC1與c-Met呈正相關(guān)(r=0.39，P<0.001)，與本組研究結(jié)果相同。本組證實(shí)ESCC中MACC1和c-Met的相關(guān)性，但具體調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

c-Met是一種酪氨酸激酶受體，參與多項(xiàng)細(xì)胞功能[17]。Lai等[18]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中c-Met高表達(dá)，c-Met過表達(dá)與神經(jīng)浸潤(P=0.007)和性別(P=0.016)顯著相關(guān)。在胃癌中，c-Met高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[19]。李雄峰等[20]的研究結(jié)果證實(shí)：c-Met高表達(dá)與肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、臨床分期有關(guān)，c-Met高表達(dá)組患者的預(yù)后較低表達(dá)組差。Ozawa等[21]研究顯示，c-Met過表達(dá)與ESCC腫瘤深度(P=0.013)和病理分期(P=0.010)相關(guān)，c-Met高表達(dá)患者的5年生存率顯著降低。另一項(xiàng)研究表明，c-Met高表達(dá)是ESCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測因子[22]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ESCC中c-Met陽性與發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.045)相關(guān)，c-Met陰性ESCC患者的生存期明顯長于c-Met陽性患者(P=0.021)，但c-Met表達(dá)與患者PFS無關(guān)(P=0.052)。Cox多因素分析與單因素分析結(jié)果一致，c-Met陽性患者的OS較差(P=0.025)。上述研究結(jié)果表明，c-Met過表達(dá)促進(jìn)ESCC的進(jìn)展，是ESCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素，c-Met可作為ESCC診斷和預(yù)測預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

本研究還存在一定局限性，首先，SOX17、MACC1和c-Met的判讀標(biāo)準(zhǔn)是暫定的，無標(biāo)準(zhǔn)化；其次，本組僅采用免疫組化分析SOX17、MACC1和c-Met蛋白表達(dá)，未進(jìn)行基因擴(kuò)增分析。

總之，ESCC中SOX17可能抑制腫瘤侵襲，MACC1可通過c-Met促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，且c-Met可作為ESCC患者潛在的預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物。本文首次分析ESCC中SOX17、MACC1、c-Met的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，為進(jìn)一步探討三種蛋白在ESCC中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。