梁家燦，文慧香，梁云貞 (.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 65000；.南華大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南衡陽(yáng) 4000；3.廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西崇左 53500)

骨碎補(bǔ)(Moore ex Bak.)是一種比較常用的中藥，具有補(bǔ)腎、強(qiáng)骨、止痛等功效，用于治療耳鳴耳聾、牙齒松動(dòng)、筋骨傷折、腎虛腰痛、跌撲閃挫等癥狀。市場(chǎng)上比較常見的主流產(chǎn)品是水龍骨科的植物槲蕨((Kunez)J.sm.)的干燥根莖。骨碎補(bǔ)研究較多的活性成分是黃酮類化合物和多糖等。多糖類物質(zhì)作為植物中主要的活性成分之一，在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育以及作為抗氧化劑等方面扮演著十分重要的角色。

內(nèi)部沸騰法具有省時(shí)、高效、反應(yīng)條件易達(dá)成等特點(diǎn)，因此相對(duì)于傳統(tǒng)水提法等，在植物有機(jī)成分的提取方面具有十分明顯的優(yōu)勢(shì)。該研究以中藥骨碎補(bǔ)作為原料，采用內(nèi)部沸騰法對(duì)其體內(nèi)多糖進(jìn)行提取，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳的內(nèi)部沸騰提取方案并在后續(xù)試驗(yàn)中測(cè)定骨碎補(bǔ)多糖的抗羥基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的氧化活性。

1 材料與方法

骨碎補(bǔ)樣品，廣西崇左市龍州縣；98%硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇，均為分析純，購(gòu)于廣東光華科技股份有限公司；三氯乙酸、正丁醇、過氧化氫，均為分析純，購(gòu)于成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)；水楊酸(≥99.5%)、FeSO·7HO(99.0%～101.0%)，購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(≥97%)，購(gòu)于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

DSY-9002高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(永康市九順瑩商貿(mào)有限公司)；V-1100D可見分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；AUW220D電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；HZ-2A恒溫水浴鍋(南京南大萬(wàn)和科技有限公司)；80-2離心沉淀機(jī)(金壇市醫(yī)療儀器廠)。

骨碎補(bǔ)樣品處理。將采回的槲蕨根莖洗凈后于電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，粉碎，過80目篩。將過篩后的槲蕨根莖粉末用石油醚脫色風(fēng)干后即為所需的骨碎補(bǔ)樣品。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。參考郭燕菲等的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確配制濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取6支試管依次準(zhǔn)確量入0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 的上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，補(bǔ)水至2 mL。用苯酚-濃硫酸法在490 nm處測(cè)定其吸光度，以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為=738+0026(=0.999 1)。

多糖提取。準(zhǔn)確稱量0.250 g骨碎補(bǔ)樣品，加入2.5 mL乙醇，室溫下解吸，加入熱蒸餾水10 mL等溫水浴提取后放入離心機(jī)中3 000 r/min離心30 min，取上清液測(cè)其多糖含量，根據(jù)公式(1)計(jì)算骨碎補(bǔ)多糖提取率。

提取率=××(××1 000)×100%

(1)

式中，為骨碎補(bǔ)樣品質(zhì)量(g)；為骨碎補(bǔ)樣品提取液定容體積(mL)；為稀釋倍數(shù)；為骨碎補(bǔ)多糖提取液測(cè)得吸光度代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算得出的骨碎補(bǔ)多糖質(zhì)量(mg)；為用于測(cè)定吸光度所移取的骨碎補(bǔ)多糖提取液(mL)。

單因素試驗(yàn)。以乙醇解吸液體積分?jǐn)?shù)為40%、解吸時(shí)間為15 min、水浴提取時(shí)間為4 min、水浴提取溫度為50 ℃分別作為基礎(chǔ)，分別固定其他3個(gè)影響因素，按照“..”方法對(duì)骨碎補(bǔ)多糖進(jìn)行內(nèi)部沸騰提取并計(jì)算比較多糖的提取率，研究不同乙醇解吸液體積分?jǐn)?shù)、解吸時(shí)間、水浴提取溫度、水浴提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。

正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將影響提取率的4個(gè)影響因子設(shè)計(jì)成4因素3水平的正交表，再根據(jù)其排列組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。通過比較提取率和正交方差確定最佳的內(nèi)部沸騰提取骨碎補(bǔ)多糖的方案。

抗氧化活性試驗(yàn)。

DPPH自由基清除能力的測(cè)定。取5支試管，分別加入2 mL“..”提取得到的不同濃度的骨碎補(bǔ)多糖溶液，在每支試管中各加入0.2 mmol/L的DPPH溶液2 mL，搖勻后置于室溫下避光靜置30 min，以無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，在517 nm下測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度，記為；取2 mL不同濃度骨碎補(bǔ)多糖溶液和2 mL無(wú)水乙醇空白對(duì)照溶液的混合液測(cè)定其吸光度，記為；測(cè)定2 mL無(wú)水乙醇空白對(duì)照溶液和0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL的混合液的吸光度，記為。以相同濃度的溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，其清除率計(jì)算公式如下：

清除率=[1-(-)/y]×100%

(2)

羥基自由基清除能力的測(cè)定。取5支試管，分別加入2 mL“..”提取得到的不同濃度的骨碎補(bǔ)多糖溶液，再加入2 mL的6 mmol/L的FeSO溶液和6 mmol/L的 HO溶液2 mL，使其充分混勻，靜置反應(yīng)10 min，再加入2 mL 的6 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液，使其充分混勻再次靜置反應(yīng)30 min，以蒸餾水作為空白對(duì)照溶液，在510 nm下測(cè)定吸光度，記為；然后以蒸餾水代替骨碎補(bǔ)多糖溶液重復(fù)上述步驟，在510 nm下可見分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，記為；以2 mL 蒸餾水代替HO溶液再次重復(fù)上述步驟，在510 nm下測(cè)定其吸光度，記為；以相同濃度的V溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，羥基自由基清除率的計(jì)算公式如下：

清除率=[1-(-)/l ]×100%

(3)

2 結(jié)果與分析

乙醇解吸液體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖提取率的影響。從圖1可以看出，當(dāng)乙醇解吸液體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)提取率達(dá)到了峰值(5.44%)。因?yàn)閮?nèi)部沸騰法的特性，浸潤(rùn)骨碎補(bǔ)樣品的乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，骨碎補(bǔ)將吸收乙醇后在后續(xù)加入熱蒸餾水并水浴提取時(shí)內(nèi)部不能形成有效的沸騰，不利于多糖的提取。而乙醇解吸液體積分?jǐn)?shù)過高可能會(huì)導(dǎo)致某些糖類物質(zhì)不易溶解，故提取率反而下降。

圖1 不同乙醇解吸液體積分?jǐn)?shù)對(duì)骨碎補(bǔ)多糖提取率的影響Fig.1 Effects of different ethanol desorption liquid fractions on the extraction rate of Rhizoma Drynariae polysaccharide

水浴提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。從圖2可以看出，當(dāng)水浴提取時(shí)間為4 min時(shí)提取率達(dá)到了峰值(6.61%)。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)使得其他非糖物質(zhì)也大量溶解于乙醇解吸液中，使得隨著水浴提取時(shí)間的延長(zhǎng)骨碎補(bǔ)多糖的提取率反而下降。

圖2 不同水浴提取時(shí)間對(duì)骨碎補(bǔ)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of different water-bath extraction time on the extraction rate of Rhizoma Drynariae polysaccharide

解吸時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。從圖3可以看出，解吸時(shí)間為15 min時(shí)提取率達(dá)到了峰值(9.32%)。乙醇解吸液與骨碎補(bǔ)樣品之間的作用時(shí)間短會(huì)導(dǎo)致乙醇解吸液未能完全滲透細(xì)胞壁，將骨碎補(bǔ)樣品內(nèi)部多糖成分充分解吸,從而使骨碎補(bǔ)多糖提取率未能達(dá)到峰值，解吸時(shí)間過長(zhǎng)非糖物質(zhì)也得到了充分的解吸，影響多糖的提取率。

圖3 不同解吸時(shí)間對(duì)骨碎補(bǔ)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of different desorption time on the extraction rate of Rhizoma Drynariae polysaccharide

水浴提取溫度對(duì)多糖提取率的影響。從圖4可以看出，水浴提取溫度在80 ℃時(shí)骨碎補(bǔ)多糖提取率達(dá)到了峰值(10.35%)。水浴溫度過高時(shí)雖然反應(yīng)足夠劇烈，但是高溫會(huì)加速乙醇解吸液的揮發(fā)，并且過高的溫度會(huì)破壞骨碎補(bǔ)內(nèi)部的活性成分，故水浴提取溫度過高骨碎補(bǔ)多糖的提取率反而降低。

圖4 不同水浴提取溫度對(duì)骨碎補(bǔ)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of different water-bath extraction temperatures on the extraction rate of Rhizoma Drynariae polysaccharide

從正交試驗(yàn)結(jié)果的極差(表1)可以看出，各因素對(duì)骨碎補(bǔ)多糖提取的影響從大到小依次為水浴提取溫度(C)>水浴提取時(shí)間(D)>解吸時(shí)間(B)>乙醇解吸液體積分?jǐn)?shù)(A)。細(xì)胞內(nèi)外溫度差是內(nèi)部沸騰法提取骨碎補(bǔ)多糖的關(guān)鍵，溫度過低則產(chǎn)生壓力不足，溫度過高則會(huì)加速乙醇的揮發(fā)影響多糖提取率。內(nèi)部沸騰法提取骨碎補(bǔ)多糖的最佳提取條件為ABCD，即乙醇解吸液體積分?jǐn)?shù)為50%，解吸時(shí)間為15 min，水浴提取溫度為80 ℃，水浴提取時(shí)間為4 min。

表1 內(nèi)部沸騰法提取骨碎補(bǔ)多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal test results of extraction of Rhizoma Drynariae polysaccharide by internal boiling method

根據(jù)得出的最佳提取條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，通過計(jì)算得出骨碎補(bǔ)多糖平均提取率為10.90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.04%。據(jù)此可以驗(yàn)證正交試驗(yàn)得出的最佳提取條件的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。所以可以確定內(nèi)部沸騰法提取骨碎補(bǔ)多糖的最佳提取條件為ABCD。

DPPH自由基清除能力的測(cè)定。從圖5可以看出，骨碎補(bǔ)多糖具有一定的DPPH自由基清除能力，其對(duì)DPPH自由基的清除率與多糖濃度相關(guān)。在多糖濃度為0.5%時(shí)，骨碎補(bǔ)多糖對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到74.8%，而作為陽(yáng)性對(duì)照的V溶液對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到了82.1%，僅相差7.3百分點(diǎn)。

圖5 骨碎補(bǔ)多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.5 The scavenging ability of Rhizoma Drynariae polysaccharide on DPPH free radicals

羥基自由基清除能力的測(cè)定。從圖6可以看出，相比V，骨碎補(bǔ)多糖對(duì)羥基自由基有良好的清除能力，當(dāng)多糖濃度為0.5%時(shí)，骨碎補(bǔ)多糖對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到78.3%，而作為參照標(biāo)準(zhǔn)的V對(duì)羥基自由基的清除率為84.1%，僅相差5.8百分點(diǎn)。表明骨碎補(bǔ)多糖濃度與清除率之間有較好的量效關(guān)系。

圖6 骨碎補(bǔ)多糖對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.6 The scavenging ability of Drynaria polysaccharide on hydroxyl radicals

3 結(jié)論與討論

該研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了內(nèi)部沸騰提取骨碎補(bǔ)多糖的最佳提取方案為乙醇解吸液體積分?jǐn)?shù)50%、解吸時(shí)間15 min、水浴提取溫度80 ℃、水浴提取時(shí)間4 min。并對(duì)其抗羥基自由基和DPPH自由基能力進(jìn)行研究，結(jié)果顯示骨碎補(bǔ)多糖對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的清除率分別達(dá)到了78.3%和74.8%，表明骨碎補(bǔ)多糖有良好的抗氧化能力。骨碎補(bǔ)作為一種傳統(tǒng)中藥材，在人體免疫疾病上有不同程度的作用。該試驗(yàn)的結(jié)果顯示，骨碎補(bǔ)中多糖成分含量較高是其發(fā)揮藥用價(jià)值的基礎(chǔ)。通過多骨碎補(bǔ)多糖提取方法和含量的研究可以更科學(xué)地對(duì)中藥進(jìn)行使用。