馮金華，于華華，李麗娜，姜 帥，鄭文靜 (.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北秦皇島 06600；.中國科學(xué)院海洋研究所，山東青島 6607；.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 006；.青島科技大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，山東青島 660)

水母是刺胞動(dòng)物在浮游生物中的代表，廣泛分布于溫帶、亞熱帶及熱帶海域。刺細(xì)胞是刺胞動(dòng)物特有的細(xì)胞器，是刺胞動(dòng)物賴以捕食和御敵的武器，當(dāng)刺細(xì)胞受到物理、化學(xué)、生物等因素的刺激時(shí)可釋放出毒液。海洋中的水母有10 000余種，其中100余種對(duì)人類有毒性，當(dāng)人類與其接觸時(shí)刺細(xì)胞中的毒液成分可經(jīng)管狀的刺絲注入皮內(nèi)，引起蜇傷。

不同水母所含刺細(xì)胞的種類各異，其釋放的毒液成分及其活性特征各不相同。不同水母造成的蜇傷癥狀復(fù)雜多樣。目前已報(bào)道的水母蜇傷癥狀最常見的是局部炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重的還包括休克、臟器衰竭，甚至死亡。隨著全球水母暴發(fā)，水母蜇傷已經(jīng)成為危害嚴(yán)重的海洋生物傷害之一。目前，國內(nèi)外對(duì)水母蜇傷的研究著重于臨床癥狀觀察以及治療、護(hù)理等方面。由于水母毒素中致病性物質(zhì)及其致病機(jī)理還不明確，水母蜇傷后的急救治療缺乏理論依據(jù)。

白色霞水母是典型的有害水母種類，既無經(jīng)濟(jì)價(jià)值，又對(duì)接觸者有較大的蜇傷毒性。自20世紀(jì)末起，東海北部至黃海、渤海水域連續(xù)發(fā)生白色霞水母暴發(fā)現(xiàn)象，且有愈演愈烈之勢。被白色霞水母蜇傷后，往往引起嚴(yán)重的皮膚損傷，受傷皮膚出現(xiàn)紅斑、瘀斑、出血等蕁麻疹斑塊；同時(shí)，還可能伴有呼吸道癥狀和全身癥狀，比如劇烈咳嗽、呼吸困難，甚至喪失意識(shí)。研究表明，白色霞水母刺細(xì)胞內(nèi)毒素具有溶血活性、神經(jīng)毒性、金屬蛋白酶和磷脂酶A活性等。目前，雖然對(duì)白色霞水母毒素的毒性成分越來越了解，但是白色霞水母毒素對(duì)哺乳動(dòng)物的毒理特性還未見報(bào)道。筆者研究了白色霞水母刺細(xì)胞毒素對(duì)小鼠的毒性作用，檢測刺細(xì)胞毒素對(duì)小鼠的致死毒性、對(duì)皮膚和內(nèi)臟組織的病理損害，探索白色霞水母毒素蟄傷的中毒機(jī)理，旨在為白色霞水母蜇傷治療和蜇傷特效藥物的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料。白色霞水母(Kishinouye)于2010年8月采自青島第一海水浴場附近，由中國科學(xué)院海洋研究所高尚武教授進(jìn)行品種鑒定。觸手從水母傘蓋處人工切除后，立即于-80 ℃下冷凍保存，備用。

主要儀器。GL-20B-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)，由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；3110BXEUR美國Mini Beadbeater珠磨機(jī)，由上海上碧實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)；PMS-100解剖鏡，由浙江托普儀器有限公司生產(chǎn)；XSZ-G光學(xué)顯微鏡，由重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn)；722S紫外可見分光光度計(jì)、FD-5N真空冷凍干燥儀，由上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；H-7000透射式電鏡，由日立高新技術(shù)公司生產(chǎn)；HH-2恒溫水浴鍋，由常州國華電器有限公司生產(chǎn)；902-ULTS超低溫冰箱，由美國Thermo公司生產(chǎn)。

主要試劑。硫酸鈉(AR)、三羥甲基氨基甲烷(AR)、磷酸氫二鈉(AR)、磷酸二氫鈉(AR)，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；牛血清白蛋白BSA(AR)由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；戊二醛(AR)由天津歐博凱化工有限公司生產(chǎn)；鹽酸(AR)由上海環(huán)發(fā)化工有限公司生產(chǎn)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。SPF級(jí)KM(昆明)小鼠，平均體重(20±2)g，購于青島市藥品檢驗(yàn)所。

刺細(xì)胞毒素的制備。

刺細(xì)胞的制備。冷凍的白色霞水母觸手用無菌海水4 ℃下浸泡(體積比1∶4)，每24 h換1次新鮮海水(保留沉淀，在此期間可用玻璃棒輕輕攪拌幾次)。4 d后，用54 μm 孔徑的濾篩過濾，去除未溶解的觸手組織和較大的組織碎片，濾液離心并收集沉淀。沉淀用0.9% NaCl溶液懸浮，13 000 r/min 離心15 min后，去掉上清液；通過顯微鏡觀察，用小勺輕輕將沉淀上層破碎的刺細(xì)胞和小的組織碎片去除，底層的沉淀重新用0.9% NaCl溶液懸浮，13 000 r/min離心；顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)沉淀中刺細(xì)胞含量在90%以上時(shí)，將沉淀收集、冷凍干燥后即得水母刺細(xì)胞樣品，-80 ℃下保存，備用。

刺細(xì)胞毒素的提取。使用Mini Beadbeater珠磨機(jī)破碎刺細(xì)胞；破碎管中加入1/2體積直徑0.5 mm的玻璃珠，再加入冷凍干燥的刺細(xì)胞和Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.8)，4 600 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩破碎，每次1 min，共4～5次，每破碎1次冰水預(yù)冷1 min。將破碎液13 000 r/min下冷凍離心15 min，所得上清液即為白色霞水母刺細(xì)胞毒素(CNV)，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

蛋白質(zhì)含量的測定。以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)，采用Bradford法測定CNV中總蛋白的含量。

CNV對(duì)小鼠的致死毒性檢測。用昆明種清潔級(jí)小鼠，設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)組(A、B、C、D、E)，每組6只，雌雄各半，皮內(nèi)注射不同濃度的CNV溶液200 μL；對(duì)照組6只小鼠，注射200 μL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.8)。觀察并記錄各組小鼠的表現(xiàn)，記錄死亡時(shí)間并統(tǒng)計(jì)24 h后的死亡數(shù)，計(jì)算LD。

CNV致皮膚壞死作用觀察。清潔級(jí)昆明小鼠10只，對(duì)照組和試驗(yàn)組各5只。試驗(yàn)前1 d，用8%硫化鈉將小鼠背部脫毛。在備毛處，采用皮內(nèi)注射的方法，試驗(yàn)組注射1個(gè)LD劑量的毒素樣品200 μL，對(duì)照組注射相同體積的Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.8)，觀察注射毒素1 h、1 d、2 d 后小鼠皮膚的變化。

CNV致小鼠組織病理變化的透射電鏡觀察。試驗(yàn)前1 d，將小鼠背部的被毛先用剪刀剪去，盡量剪短，但不要剪破皮膚。然后，用溫水將該部位潤濕，再用紗布包扎棉球的小棒蘸脫毛劑(8%NaS溶液)，在需脫毛部位涂1層，2～3 min后用溫水洗去該部位脫下的毛，自然晾干，備用。

將小鼠完全隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組2組，每組5只。試驗(yàn)組在小鼠背部備皮處皮內(nèi)注射1個(gè)LD劑量的毒素樣品200 μL；對(duì)照組注射相同體積的Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.8)。

配制含5%戊二醛的PBS緩沖液(150 mmol/L，pH 7.3～7.4)及生理鹽水，置于4 ℃下預(yù)冷，作為固定液。

注射毒素樣品4 h后，立即將小鼠解剖，取對(duì)照組和試驗(yàn)組注射部位皮膚、心、肺、肝、腎。取材時(shí)，先在解剖盤上滴2滴固定液，在5%固定液中迅速用雙面刀片切取小塊樣品放入固定液中，1 h內(nèi)迅速將小塊樣品切成體積0.5 mm的小塊，放入盛有固定液的樣品瓶(置于4 ℃冰箱中預(yù)冷)。由于肺組織內(nèi)部有氣體無法徹底排放，導(dǎo)致肺組織懸浮于固定液表面，固定液不能及時(shí)滲透進(jìn)組織內(nèi)部，從而導(dǎo)致大部分組織固定不良，所以取紗布條壓于肺組織小塊上，使組織沉底，全部浸泡在固定液中保存。應(yīng)用解剖鏡，將心臟組織小塊沿肺纖維方向修成長條狀。為了防止采集過程中細(xì)胞快速死亡自溶，環(huán)境溫度應(yīng)保持在0～10 ℃。將上述固定好的樣品用1%OsO作后固定，經(jīng)乙醇梯度脫水、國產(chǎn)618環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片機(jī)切片，用醋酸雙氧鈉和檸檬酸鉛染色，最后使用日立H-7000型透射電鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

小鼠皮內(nèi)注射毒素后開始觀察，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)靜伏少動(dòng)、豎毛、蜷縮、后肢伸展、松弛、走路蹣跚、感覺稍遲鈍、行動(dòng)緩慢，睜眼困難，食欲減退，嚴(yán)重者出現(xiàn)全身抽搐、呼吸急促、死亡等中毒癥狀。

如表1所示，CNV致小鼠死亡率呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當(dāng)毒素劑量為43.65 mg/kg時(shí)可致小鼠快速死亡，小鼠出現(xiàn)全身抽搐、呼吸急促，1～4 h內(nèi)死亡4只，24 h后死亡6只；當(dāng)毒素劑量為38.80 mg/kg時(shí)，小鼠4 h內(nèi)死亡2只，另有3只出現(xiàn)靜伏少動(dòng)、不食、呼吸急促、睜眼困難等癥狀，24 h后死亡5只。隨著毒素劑量的降低，注射毒素后小鼠越活潑，癥狀越不明顯，存活時(shí)間越長。

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，全部動(dòng)物均表現(xiàn)為呼吸先完全停止，待肉眼觀察到小鼠呼吸停止后再打開胸腔，暴露出心臟，心臟仍維持跳動(dòng)2～10 min。

參照熊浩明等的方法，按表1數(shù)據(jù)計(jì)算得出，CNV致小鼠死亡的LD為33.64 mg/kg。

表1 CNV對(duì)小鼠的致死作用Table 1 The lethal effect of CNV on mice

如圖1所示，試驗(yàn)組小鼠皮內(nèi)注射33.64 mg/kg的毒素樣品200 μL，1 h后注射部位開始隱現(xiàn)紅色區(qū)域，隨著時(shí)間的推移，皮膚損傷癥狀逐漸明顯；1 d后，注射部位皮膚中央凹陷，出現(xiàn)暗紅色斑塊，周圍出現(xiàn)小鼠抓傷的痕跡；隨著時(shí)間的延長，斑塊繼續(xù)向外沿?cái)U(kuò)展，顏色變?yōu)樽虾稚砻嫫つw變硬；2 d后，注射部位形成焦痂，呈壞死癥狀。隨著時(shí)間的延長，深褐色焦痂繼續(xù)增厚甚至潰爛。對(duì)照組小鼠皮膚沒有觀察到明顯病理變化。

皮膚超微結(jié)構(gòu)變化。圖2為注射33.64 mg/kg的CNV 4 h后對(duì)照組(Control)和試驗(yàn)組(A)小鼠注射部位皮膚的超微結(jié)構(gòu)圖。從圖2可以看出，對(duì)照組細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核核膜完整，可見核仁。試驗(yàn)組小鼠皮膚腺體細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)多種明顯結(jié)構(gòu)變化，腺體顆粒囊泡化(黑色箭頭所示為白色泡狀結(jié)構(gòu))；細(xì)胞呈溶解狀態(tài)；電子密度明顯降低；細(xì)胞核皺縮，細(xì)胞核的核膜溶解(N所示)；染色質(zhì)濃縮，邊緣化凝集成板塊樣，分布于核膜處。從超微結(jié)構(gòu)圖可以看出，細(xì)胞變性，出現(xiàn)壞死特征。

注：Ⅰ.SPF級(jí)小鼠皮內(nèi)注射33.64 mg/kg的CNV 1 h后；Ⅱ.SPF級(jí)小鼠皮內(nèi)注射33.64 mg/kg的CNV 1 d后；Ⅲ.SPF級(jí)小鼠皮內(nèi)注射33.64 mg/kg的CNV 2 d后 Note：Ⅰ.After SPF mice were injected 33.64 mg/kg CNV by intradermal injection 1h；Ⅱ.After SPF mice were injected 33.64 mg/kg CNV by intradermal injection 1 d；Ⅲ.After SPF mice were injected 33.64 mg/kg CNV by intradermal injection 2 d圖1 CNV致小鼠皮膚壞死作用Fig.1 The skin necrosis of mice induced by CNV

圖2 CNV致小鼠皮膚超微結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Ultrastructural changes of mice skin induced by CNV

肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。如圖3所示，注射33.64 mg/kg 的CNV 4 h后，對(duì)照組(Control)小鼠肝臟組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)清晰、正常，肝細(xì)胞核呈圓形，胞質(zhì)中糖原顆粒豐富(黑色箭頭所示)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體豐富。試驗(yàn)組(A)小鼠肝細(xì)胞細(xì)胞器最顯著的變化為肝糖原顆粒大量減少，甚至消失；其他變化包括核膜有部分溶解，核內(nèi)基質(zhì)略有減淡，染色質(zhì)向核膜聚集，線粒體有腫脹現(xiàn)象；但細(xì)胞核大小、形狀正常。此外，肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)無其他明顯變化。

圖3 CNV致小鼠肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Ultrastructural changes of mice liver cells induced by CNV

腎臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。從圖5可以看出，與對(duì)照組(Control)相比，受毒素的影響，試驗(yàn)組小鼠腎臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的病理變化。主要表現(xiàn)如下：細(xì)胞核發(fā)生皺縮，染色質(zhì)凝集程度增加、呈邊緣化聚集，部分區(qū)域板塊樣聚集(A)，核內(nèi)電子密度明顯降低(A)并出現(xiàn)核膜溶解(A)；部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張水腫，呈現(xiàn)泡狀結(jié)構(gòu)(黑色箭頭所指)；大量線粒體腫脹、基質(zhì)減淡，嵴減少，有空泡化現(xiàn)象，外膜部分溶解，部分線粒體內(nèi)開始出現(xiàn)無定形電子致密物(A、A)，并出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu)。這表明毒素使小鼠腎臟組織受到嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞有壞死跡象。

心臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。如圖6所示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠的肌漿網(wǎng)和肌原纖維沒有明顯變化；細(xì)胞核出現(xiàn)微皺縮；線粒體完整，部分線粒體出現(xiàn)腫脹，但內(nèi)嵴有微溶解現(xiàn)象；細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu)。整個(gè)心臟向功能衰弱的方向發(fā)展，但并未出現(xiàn)衰竭的跡象。

圖4 CNV致小鼠肺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化Fig.4 Ultrastructural changes of mice lung cells induced by CNV

注：A1、A2為試驗(yàn)組小鼠腎小管細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) Note：A1 and A2 were the ultra-structure of tubular cells in mice in the experimental group 圖5 CNV致小鼠腎臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化Fig.5 Ultrastructural changes of mice kidney cells induced by CNV

該研究結(jié)果表明CNV可引發(fā)小鼠明顯的中毒反應(yīng)，甚至死亡。CNV皮內(nèi)注射對(duì)小鼠的LD為33.64 mg/kg，屬于高度危害毒性。王蓓蕾采用尾靜脈注射的方式進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)獅鬃水母()的觸手提取液對(duì)小鼠的LD為5.484 mg/kg；Li等研究發(fā)現(xiàn)沙蜇()對(duì)小鼠靜脈注射的LD為2.92 μg/g。通過不同水母毒素的LD大小可以看出毒性的強(qiáng)弱。由此可見，白色霞水母毒素相對(duì)于我國常見大型蜇人水母毒性較弱，可能這也是目前尚未見到關(guān)于白色霞水母致重癥蟄傷患者報(bào)道的原因。

注射1個(gè)LD劑量的CNV 4 h后，超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)小鼠注射部位皮膚細(xì)胞線粒體、基質(zhì)、細(xì)胞核、染色質(zhì)等都發(fā)生明顯壞死。1～2 d后，小鼠皮膚表現(xiàn)出壞死癥狀，注射部位顏色變深，隨著時(shí)間的延長，出現(xiàn)結(jié)痂和潰爛現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道，水母蜇傷后的局部癥狀以紅斑、丘疹為主，嚴(yán)重蟄傷時(shí)可導(dǎo)致色素沉著、瘢痕形成、壞疽。這與該研究報(bào)道的CNV具有皮膚壞死活性相吻合。

小鼠皮內(nèi)注射33.64 mg/kg的CNV 4 h后，對(duì)皮膚及臟器的超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)小鼠的皮膚和臟器表現(xiàn)出不同程度的損傷。其中，比較明顯的損傷出現(xiàn)在皮膚、肺臟和腎臟，而肝臟和心臟的損傷相對(duì)較輕。注射獅鬃水母的觸手提取液2.4 mg/kg 1 h后致大鼠模型引起嚴(yán)重的心肺損傷，但其對(duì)肝、腎的損傷較輕。沙蟄毒素可引起肺水腫和惡性胸腔積液，病理切片分析顯示腎臟和肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷，但心臟、脾、胃未見明顯改變。由于不同水母中所含毒性成分的差異，其引起的中毒癥狀、作用部位及中毒機(jī)理等有所差別。

CNV致小鼠肺組織細(xì)胞病變嚴(yán)重，出現(xiàn)明顯水腫樣變化，肺水腫病變會(huì)直接引起呼吸困難。從CNV致小鼠肺組織病變可以看出，白色霞水母蟄傷嚴(yán)重者可能會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的肺水腫。多篇文獻(xiàn)記載水母蟄傷致患者出現(xiàn)呼吸困難、咳大量泡沫樣痰等急性肺水腫表現(xiàn)，最終導(dǎo)致的呼吸循環(huán)衰竭也被認(rèn)為是致死的常見原因之一。肺水腫可能是多種水母蟄傷嚴(yán)重患者出現(xiàn)的共有癥狀。

腎功能衰竭可能是CNV引起小鼠死亡的又一重要原因。毒素除了引起小鼠肺臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯病變外，也引起腎臟嚴(yán)重的病理變化，腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)壞死。腎細(xì)胞的嚴(yán)重病變可能導(dǎo)致腎功能衰竭。目前已有關(guān)于海月水母、海蜇蜇傷致急性腎功能衰竭的報(bào)道。

據(jù)報(bào)道，水母毒素有心臟毒性，可能是發(fā)狀霞水母蜇傷致死的主要原因。但是，CNV在致死劑量下對(duì)小鼠心臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響不明顯，且解剖發(fā)現(xiàn)小鼠呼吸停止但心臟仍能維持跳動(dòng)一段時(shí)間。這說明心臟毒性可能不是白色霞水母毒素致死的主要原因。

注：Control Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ為對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，A1、A2、A3為試驗(yàn)組小鼠心肌的超微結(jié)構(gòu) Note: Control Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ were the ultra-structure of the myocardial cells in mice in the control group, A1, A2, A3 were the ultra-structure of the myocardial cells in mice in the experimental group 圖6 CNV致小鼠心臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化Fig.6 Ultrastructural changes of mice heart cells induced by CNV

該研究揭示了白色霞水母毒素的部分毒性特征，為白色霞水母蟄傷的救治提供了試驗(yàn)依據(jù)。若要進(jìn)一步了解其毒理特性，還需要明確毒素中每一種毒性成分及其功能。