謝 韜，楊碧蓉，何培芝，周 華

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院婦科，上海 201203)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMT)指有活性的子宮內(nèi)膜組織(腺體或間質(zhì))已經(jīng)種植在子宮體外的疾病。臨床上常表現(xiàn)為漸進(jìn)性加重性痛經(jīng)、難治性不孕且極易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的身心和生殖健康[1]。中醫(yī)認(rèn)為，EMT的病理基礎(chǔ)為血瘀，多因風(fēng)寒侵襲、經(jīng)產(chǎn)留瘀、素性抑郁等導(dǎo)致離經(jīng)之血蓄積胞中，瘀阻胞脈沖任，血不歸經(jīng)，氣血津液運(yùn)行失常，導(dǎo)致濕瘀互阻，積結(jié)日久，形成癥瘕包塊，治療以活血化瘀為大法。桂枝茯苓丸為經(jīng)典的活血化瘀、消癥散結(jié)方，被稱為“消癥第一方”，首載于《金匱要略》，“婦人宿有癥病，經(jīng)斷未及三月……所以血不止者，其癥不去故也，當(dāng)下其癥，桂枝茯苓丸主之”[2]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)認(rèn)為，藥物治療疾病是在各藥物組成成分的干預(yù)下，經(jīng)多靶點(diǎn)、多途徑實現(xiàn)共同干預(yù)[3]。尤其在中藥的藥理學(xué)研究領(lǐng)域，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析較為常用和典型。中藥復(fù)方治療疾病遵循整體觀思想。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性，并注重藥物間相互作用，與中醫(yī)藥學(xué)基本特點(diǎn)存在一定相似之處，符合中醫(yī)藥對疾病本質(zhì)的認(rèn)識[4-5]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討桂枝茯苓丸的靶點(diǎn)、活性成分和分子作用機(jī)制，希望進(jìn)一步了解該藥在EMT治療領(lǐng)域的藥理機(jī)制，促進(jìn)臨床合理用藥。

1 資料與方法

1.1 活性成分及其作用靶點(diǎn)的篩選

通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)檢索出桂枝茯苓丸中桂枝、茯苓、赤芍、桃仁和牡丹皮5種中藥的化學(xué)成分及其相關(guān)靶點(diǎn)，并進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)：Score cutoff>20，AdjustedP-value<0.05。

1.2 EMT靶點(diǎn)的獲取

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)中搜索關(guān)鍵詞“endometriosis”，得到EMT相關(guān)靶點(diǎn)并進(jìn)行記錄。

1.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選及構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

應(yīng)用R軟件(v4.0)將桂枝茯苓丸化學(xué)成分作用靶點(diǎn)和EMT相關(guān)的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射構(gòu)建韋恩圖。存在交集的共同靶點(diǎn)可能是桂枝茯苓丸中活性成分治療EMT的關(guān)鍵靶點(diǎn)。以STRING數(shù)據(jù)庫 (http://string-db.org/)作為操作平臺，以共同靶蛋白為基礎(chǔ)，確定“Homosapiens”蛋白種屬，在“medium confidence”(>0.4)基礎(chǔ)上構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因功能注釋和通路富集分析

篩選出的共同靶基因的基因本體(GO)以R軟件(v4.0)進(jìn)行功能注釋，所預(yù)測化學(xué)成分靶點(diǎn)的富集分析在京都基因與基因組百科全書(KEGG)平臺上進(jìn)行操作，保留P≤0.01的結(jié)果，進(jìn)行可視化處理，分析桂枝茯苓丸治療EMT可能的生物過程和信號通路。

2 結(jié)果

2.1 桂枝茯苓丸成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

共篩選出桂枝茯苓丸5味中藥51種類藥成分，其中，桂枝16種，茯苓18種，赤芍8種，桃仁3種，牡丹皮6種；共涉及823個靶點(diǎn)。

2.2 EMT疾病靶點(diǎn)的篩選及共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

檢索GeneCard、BATMAN-TCM等數(shù)據(jù)庫，將獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行“去重”操作后得到1 600個不重復(fù)的疾病靶點(diǎn)。利用R軟件制作1 600個疾病靶點(diǎn)與823個桂枝茯苓丸類藥成分作用靶點(diǎn)的韋恩圖，獲得疾病-類藥活性成分共同靶點(diǎn)190個，見圖1。以STRING數(shù)據(jù)庫為操作平臺，對上述靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到PPI作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖1 中藥靶點(diǎn)基因和疾病靶點(diǎn)基因的交集韋恩圖

2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)GO生物功能注釋

應(yīng)用R軟件中clusterProfiler包對桂枝茯苓丸成分-EMT疾病的190個共同作用靶蛋白進(jìn)行GO生物功能注釋，根據(jù)保留P≤0.01的結(jié)果，進(jìn)行可視化分析，得到GO分析柱狀圖，見圖3?？梢姡餐饔冒悬c(diǎn)主要富集在受體配體活性(receptor ligand activity)、激素活性(hormone activity)、生長因子活性(growth factor activity)、生長因子受體結(jié)合(growth factor receptor binding)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding)和細(xì)胞因子活性(cytokine activity)等55個生物過程。表明桂枝茯苓丸可能通過調(diào)節(jié)受體配體活性及生長因子受體結(jié)合等方面治療EMT。

2.4 KEGG通路富集分析

應(yīng)用R軟件中clusterProfiler包對桂枝茯苓丸成分-EMT疾病的190個共同作用靶蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)保留P≤0.01的結(jié)果，可視化分析，得到KEGG通路富集氣泡圖，見圖4?？梢姡餐悬c(diǎn)主要富集于非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease)、美洲錐蟲病(chagas disease)、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號通路(MAPK signalingpathway)、細(xì)胞因子間相互作用(cytokine-cytokin-ereceptorinteraction)和內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)等。

2.5 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖

通過Cytoscape 3.2.1軟件繪制桂枝茯苓丸的“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，見圖5；網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D分析見表1。圖5中，箭頭代表桂枝茯苓丸中的五味中藥，菱形代表五味中藥所含的各種成分，橢圓形代表相關(guān)靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，桂枝茯苓丸通過5味中藥所含的47種成分作用于190個相關(guān)靶點(diǎn)治療EMT。

表1 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D分析表

3 討論

3.1 EMT的病機(jī)和治療

EMT的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，目前被廣泛接受的是“在位內(nèi)膜決定論”，即子宮在位內(nèi)膜細(xì)胞通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化具備了轉(zhuǎn)移侵襲的能力，進(jìn)而與同種細(xì)胞脫離，穿過腹水或腹腔液、腹腔細(xì)胞和腹腔外基質(zhì)三道防線進(jìn)入腹腔完成異種細(xì)胞間的黏附，為進(jìn)一步的侵襲和病灶血管形成奠定基礎(chǔ)[6-7]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)以手術(shù)和激素類藥物治療為主，但其應(yīng)用有限。近年來，中醫(yī)藥在緩解EMT痛經(jīng)、縮小包塊和促進(jìn)生育方面療效顯著。

圖2 桂枝茯苓丸治療EMT的靶點(diǎn)基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 GO功能富集分析柱狀圖

3.2 桂枝茯苓丸的效用和現(xiàn)代藥理學(xué)探討

“血水同治”為桂枝茯苓丸治療EMT的典型療效，方中桂枝為君藥，味辛、甘，性溫，主通脈祛瘀、助氣行水；茯苓為臣藥，可利腰臍間血；桃仁味甘、性平，消癥且不傷正，協(xié)同茯苓共奏利水滲濕之功；芍藥柔肝調(diào)血；丹皮活血涼血消癥[8]。眾多醫(yī)家以該方為基礎(chǔ)治療EMT，獲得了滿意的臨床療效，至今仍被廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果證實，桂枝有抗病毒、抗菌、抗炎、抗凝、抗血小板聚集和抗過敏等療效[9]；茯苓有抗病毒、抗炎、抗氧化、保肝和利尿等功效[10]；赤芍有抗血栓、抗腫瘤、保肝和抗凝等療效[11]；桃仁有抗氧化、抗炎、活血祛瘀和促進(jìn)血流動力學(xué)改善等療效[12]；牡丹皮能抗炎、抗菌，調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)。盡管現(xiàn)代藥理學(xué)對桂枝茯苓丸各成分的藥理作用有深入的研究，但是對于全方的藥理學(xué)機(jī)制和臨床治療EMT的作用機(jī)制卻少有報道[13]。

圖4 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖5 桂枝茯苓丸“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖

3.3 有效藥物成分的機(jī)制分析

本研究中發(fā)現(xiàn)，在中藥-成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)中，苯乙烯、麥角胺、間羥基肉桂酸、八仙花酸和去氫齒孔酸的自由度高。但目前仍不了解上述藥物成分在EMT治療中發(fā)揮的作用，有待深入研究。

3.4 桂枝茯苓丸治療EMT的潛在靶點(diǎn)預(yù)測

在中藥-成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)中，自由度高的靶點(diǎn)有CB1、CB2、ESR1和PGR1。CB1被發(fā)現(xiàn)主要表達(dá)于子宮、胎盤、睪丸以及中樞神經(jīng)組織中[14]。CB2可表達(dá)于多種免疫細(xì)胞中。研究結(jié)果表明，2種大麻素受體均可參與EMT的細(xì)胞增殖、凋亡、黏附、侵襲和血管形成過程，進(jìn)而影響EMT的發(fā)生發(fā)展[15]。大麻素受體還可調(diào)控異位子宮內(nèi)膜組織的神經(jīng)生長[16]。CB1和CB2在異位內(nèi)膜中與磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路關(guān)系密切，可以通過抑制后者的活性起到抗細(xì)胞增殖的作用[17]。胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)信號通路可與PI3K/Akt信號通路相結(jié)合，共同參與CB激動劑甲烷甲酰胺增強(qiáng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的遷移過程，研究檢測到經(jīng)甲烷甲酰胺處理后的異位內(nèi)膜中N-鈣黏蛋白及白細(xì)胞介素6的表達(dá)增加，提示CB1促進(jìn)了異位內(nèi)膜細(xì)胞的黏附、侵襲過程[18-19]。經(jīng)遷移、黏附、侵襲以及心血管生成等變化后，異位子宮內(nèi)膜可發(fā)展形成異位病灶。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管生成過程中的關(guān)鍵因子，大麻素受體已被證實能夠在多種惡性腫瘤細(xì)胞中有效阻斷VEGF通路，繼而抑制腫瘤血管生成[20]。

雌激素在EMT異位病灶中的水平高于同期血清水平，始終是異位病灶微環(huán)境中發(fā)病的關(guān)鍵因素[21]。高雌激素水平在EMT中發(fā)揮促進(jìn)病灶細(xì)胞增殖、促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、促血管形成以及促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生等作用[22]。因此，減少雌激素的合成對于EMT的治療具有重要作用。雌激素受體(ER)β可以誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)誘導(dǎo)異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖[23]；并可以抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的凋亡過程[24]。β-聯(lián)蛋白(β-catenin)反映上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，β-catenin主要作用于細(xì)胞骨架，能夠與上皮細(xì)胞的鈣黏蛋白構(gòu)成復(fù)合體，對細(xì)胞間的相互黏附作用進(jìn)行介導(dǎo)。研究結(jié)果指出，在EMT發(fā)病的初始階段，ER能夠與β-catenin的雌激素反應(yīng)元件結(jié)合進(jìn)而啟動β-catenin的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞的EMT[25]。在異位病灶形成過程中，ER上調(diào)β-catenin轉(zhuǎn)錄激活了Wnt/β-catenin信號通路，后者能夠直接促進(jìn)VEGF的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)病灶周圍小血管的形成，為病灶形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

孕激素抵抗是EMT形成的重要機(jī)制，但抵抗的具體原因不完全明確[26]。Tanaka等[27]指出，在EMT中，雌激素和孕激素信號可以調(diào)節(jié)大麻素受體mRNA的表達(dá)，說明三者之間存在聯(lián)系，影響著EMT的發(fā)生發(fā)展。

ALOX5是炎癥介質(zhì)白細(xì)胞三烯和脂氧素生成的一個起始酶，在腫瘤等疾病中通常表達(dá)量過高[28]。EMT為一種良性腫瘤，但其發(fā)病機(jī)制與一般的惡性腫瘤具有一定的相似性。孫平平等[29]認(rèn)為，ALOX5在EMT組織中的高表達(dá)，與EMT發(fā)病存在一定關(guān)系，通過上調(diào)VEGF表達(dá)促進(jìn)EMT新生血管形成。

綜合上述藥物作用的靶點(diǎn)，桂枝茯苓丸可能通過CB1、CB2、ESR、PGR和ALOX5等靶點(diǎn)調(diào)控EMT中異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖抗凋亡、黏附、侵襲和血管生成的過程，從而起到治療EMT的作用。

3.5 桂枝茯苓丸治療EMT的潛在通路預(yù)測分析

從KEGG通路富集分析結(jié)果可知，在治療過程中可能涉及的主要通路為MAPK信號通路。MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在哺乳動物體內(nèi)廣泛存在，并接受細(xì)胞外信號刺激，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移以及衰老的過程；同時，其與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生關(guān)系密切[30]。ERK1/2、c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)、P38絲裂原活化蛋白激酶(P38)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)均為MAPK信號通路，且各分支通路的生物效能各不相同[31]。MAPK信號通路調(diào)節(jié)EMT中異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞黏附、侵襲、血管生成和抗凋亡的過程，參與EMT的發(fā)生發(fā)展[32]。MAPK信號通路還可促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲，主要作用機(jī)制為作用于多種細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)的細(xì)胞黏附運(yùn)動。侵襲過程涉及到細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是該過程中的主要酶類，多種因子可以通過通路間接調(diào)控MMP的表達(dá)，有利于異位侵襲種植。新生血管形成是EMT異位病灶形成的關(guān)鍵，異位病灶需要足夠的血液供應(yīng)支持，并且其快速生長離不開大量新生血管的供應(yīng)。在環(huán)氧合酶-2(COX-2)的誘導(dǎo)下，VEGF可加速合成，促進(jìn)新血管的生成。Huang等[33]研究結(jié)果指出，EMT中過量表達(dá)的白細(xì)胞介素1β通過MAPK信號通路刺激COX-2的表達(dá)，間接促進(jìn)了VEGF的表達(dá)。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與技術(shù)，挖掘到桂枝茯苓丸中51種類藥性成分及823個潛在靶點(diǎn)，EMT相關(guān)靶點(diǎn)1 600個，其中桂枝茯苓丸-疾病共同靶點(diǎn)190個；進(jìn)行GO生物分析初步預(yù)測出桂枝茯苓丸可能通過調(diào)節(jié)CB1、CB2、ESR、PGR和ALOX-5等靶點(diǎn)，通過KEGG通路富集分析和過程分析初步預(yù)測出桂枝茯苓丸可能通過調(diào)控MAPK信號通路，從而發(fā)揮抗炎、抗腫瘤和促凋亡等作用，從EMT中異位內(nèi)膜細(xì)胞的黏附、侵襲和血管生成等病理過程干預(yù)，達(dá)到治療EMT的作用，對臨床治療具有重要意義。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是依托于已研究出的數(shù)據(jù)，借助各種平臺數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)及配套的軟件算法進(jìn)行分析，得出的結(jié)果可作為實驗研究的線索，其具體的作用機(jī)制還有待實驗研究證實。