王玉萍，雷 琪，付萍萍，馬 暢

(陜西省農(nóng)業(yè)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 西安 710003)

1 前言

膽鈣化醇滅鼠劑是一種安全性好、可以防治對(duì)抗凝血滅鼠劑產(chǎn)生抗藥性的新型滅鼠劑，在美國(guó)、新西蘭等發(fā)達(dá)國(guó)家得到廣泛應(yīng)用，我國(guó)也于2012年獲得登記[1]。膽鈣化醇又名維生素D3，是一種對(duì)人類及高等動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、維持生命和保證健康不可缺少的脂溶性維生素，其主要作用是調(diào)節(jié)鈣、磷代謝，促進(jìn)腸內(nèi)鈣、磷的吸收和骨質(zhì)鈣化，維持血鈣和血磷的平衡，在食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用多年[2]。

2 試驗(yàn)部分

2.1 試劑和溶液 甲醇：色譜純；水：新蒸二次蒸餾水或超純水；膽鈣化醇標(biāo)樣：已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)，ω≥99.9%；膽鈣化醇0.075%餌粒。

2.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent 1 260，具有二極管陣列檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器；Agilent色譜工作站；色譜柱：150mm×4.6mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)裝ZORBAX SB-C18、5μm填充物。

2.3 液相色譜操作條件 流動(dòng)相：Ψ(甲醇 ：水)=95 ：5，經(jīng)濾膜過(guò)濾，并進(jìn)行脫氣；流量：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：264nm；進(jìn)樣體積：5μL；保留時(shí)間：膽鈣化醇約12.6min。典型的膽鈣化醇的標(biāo)樣、樣品色譜圖(圖1、圖2)。

圖1 膽鈣化醇標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

圖2 膽鈣化醇0.075%餌粒試樣液相色譜圖

2.4 測(cè)定步驟

2.4.1 標(biāo)樣溶液的配制 稱取膽鈣化醇標(biāo)樣0.05g(精確至0.000 1g)于100mL容量瓶中，用70mL甲醇超聲溶解，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度并搖勻，用移液管移取上述溶液2.0mL于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。

2.4.2 試樣溶液的配制 稱取研磨后的3.0g(精確至0.000 1g)膽鈣化醇餌粒樣品于具塞錐形瓶中，加入70mL甲醇，55℃超聲35min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，多次潤(rùn)洗定容至刻度并搖勻，靜置備用。

2.4.3 測(cè)定 在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針膽鈣化醇峰面積相對(duì)變化<1.2%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

2.4.4 計(jì)算 將測(cè)得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中膽鈣化醇峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中膽鈣化醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

ω1——試樣中膽鈣化醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

A2——試樣溶液中膽鈣化醇峰面積的平均值；

m1——膽鈣化醇標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

ω——標(biāo)樣中膽鈣化醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

A1——標(biāo)樣溶液中膽鈣化醇峰面積的平均值；

m2——試樣的質(zhì)量，g。

f——稀釋倍數(shù)，f=25。

3 結(jié)果分析

3.1 色譜條件選擇 色譜柱選擇常用的ZORBAX SB-C18反相柱。根據(jù)膽鈣化醇物化性質(zhì)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 17818-2010 飼料中維生素D3的測(cè)定 高效液相色譜法》，選擇甲醇作為溶劑溶解樣品，并以甲醇和水作為流動(dòng)相。為了得到更好的分離效果和峰形，將流動(dòng)相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，隨著甲醇比例的減少，保留時(shí)間增加，當(dāng)甲醇與水比例達(dá)到97：3時(shí)，有雜質(zhì)峰干擾膽鈣化醇，峰純度達(dá)不到試驗(yàn)要求，最終選擇Ψ(甲醇 ：水)=95 ：5作為流動(dòng)相，流速1.0mL/min。該條件下，膽鈣化醇色譜峰峰形較好，與雜質(zhì)能完全分離，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，并且分析時(shí)間較短，提高了工作效率。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)Agilent1260高效液相色譜儀的光譜數(shù)據(jù)采集功能，經(jīng)紫外光譜掃描膽鈣化醇的最大吸收波長(zhǎng)約在210nm和264 nm處，在210nm處?kù)`敏度較高，但干擾較大，在第二大吸收波長(zhǎng)264nm處?kù)`敏度尚可，且干擾較小，能夠滿足分析要求，故將檢測(cè)波長(zhǎng)確定為264 nm(圖3)。

圖3 膽鈣化醇的紫外光譜圖

3.3 樣品配置過(guò)程的優(yōu)化 由于餌粒制劑的特殊性，樣品稱取前必須充分研磨，且避光保存，在樣品超聲過(guò)程中，分別對(duì)超聲溫度和超聲時(shí)間進(jìn)行了梯度比對(duì)，最后確定在55℃超聲35min后，樣品中膽鈣化醇能夠充分溶解。

3.4 分析方法的線性相關(guān)性試驗(yàn) 按2.4.1標(biāo)樣溶液的制備方法配制6.4～63.7mg/L 5個(gè)不同濃度的有效成分線性相關(guān)溶液，分別標(biāo)記為STD1至STD5。在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，按照STD1至STD5的順序測(cè)定每個(gè)溶液中膽鈣化醇的峰面積，取兩次測(cè)定的平均結(jié)果。以膽鈣化醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程為y=25.446x+29.228，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8(圖4)。

圖4 膽鈣化醇線性關(guān)系圖

3.5 分析方法的精密度試驗(yàn) 按2.4.2試樣溶液的制備方法配制5個(gè)0.075%膽鈣化醇餌粒精密度溶液，以有效成分線性相關(guān)溶液STD3為標(biāo)樣溶液，在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、精密度溶液、精密度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果(表1)。

表1 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.6 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 稱取約1.5g(精確至0.000 1g)膽鈣化醇的0.075%膽鈣化醇餌粒于100 mL容量瓶中，再分別加入2.4.1中膽鈣化醇標(biāo)準(zhǔn)溶液母液約2.0mL，按2.4.2試樣溶液的制備方法配制5個(gè)有效成分準(zhǔn)確度溶液，以線性相關(guān)溶液STD3為標(biāo)樣溶液，在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、準(zhǔn)確度溶液、準(zhǔn)確度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果(表2)。

表2 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

3.7 方法特異性 本試驗(yàn)采用HPLC-DAD峰純度分析法來(lái)鑒別膽鈣化醇。膽鈣化醇標(biāo)樣、0.075%膽鈣化醇餌粒的膽鈣化醇HPLC-DAD峰純度均>990，有效成分處無(wú)其它物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。峰純度色譜圖(圖5、圖6)。

圖5 膽鈣化醇標(biāo)樣HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖6 0.075%膽鈣化醇餌粒HPLC-DAD峰純度色譜圖

4 結(jié)論

本文建立了檢測(cè)膽鈣化醇餌粒中有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高效液相色譜分析方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，膽鈣化醇在測(cè)試濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，有較高的準(zhǔn)確度和精密度，具有分離效果好，分析時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，符合定量分析要求，是一種高效、快速、準(zhǔn)確的分析方法。