韓昭， 高艷玲， 張建忠， 張伶， 徐艷艷， 李小靜

1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，2.邯鄲市中心醫(yī)院急診科，河北 邯鄲 056002

惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是一種惡性度極高的腫瘤，發(fā)病率和死亡率逐年增高。本病進(jìn)展快，一旦確診,多屬于晚期，我國每年新增的黑色素瘤患者顯著增加[1]，且目前本病發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療手段局限。自噬在機(jī)體的病理和生理過程中十分常見，其對于維持細(xì)胞的穩(wěn)定具有重要作用[2]。自噬活動及其相關(guān)基因的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，細(xì)胞自噬和生物學(xué)行為通過分子調(diào)控機(jī)制相互協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化。Beclin1蛋白是調(diào)控自噬的關(guān)鍵標(biāo)志蛋白,在自噬體形成早期發(fā)揮重要作用[3]。目前已有多項(xiàng)研究證實(shí)，Beclin1基因與多種惡性腫瘤有著復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，如肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等[4]。前期研究結(jié)果顯示，Beclin1過表達(dá)對黑素瘤SK-MEL-2細(xì)胞的生長增殖及侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為起到抑制作用[5]。上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是胚胎發(fā)育過程中正常的生理過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中同樣扮演著重要角色。已有研究顯示，MM的發(fā)病與其EMT過程有密切關(guān)系[6]。本研究應(yīng)用裸鼠皮下異種移植瘤模型，進(jìn)一步觀察Beclin1的過表達(dá)對黑色素瘤自噬水平及EMT過程的影響，以期為今后Beclin1基因用于人黑素瘤的基因治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑

BABLc裸鼠由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供；黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375購自中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所。兔抗人單克隆抗體Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin均購自美國Abcam公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自上海世豐生物技術(shù)有限公司；10%胎牛血清及青鏈霉素購自美國Hyclone公司；Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin和E-cadheirn PCR引物的設(shè)計(jì)及合成由Thermo Fisher公司完成；lipofectamin 2000購自美國Invitrogen公司；Trizol提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒購自中國Takara公司；Real time PCR Master Mix(SYBR Green)購自中國Takara公司；Western blotting檢測試劑盒購自中國江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱產(chǎn)自日本SANYO公司；超凈工作臺產(chǎn)自中國蘇州凈化公司；生物倒置顯微鏡產(chǎn)自日本OLYMPUS公司；紫外光度儀產(chǎn)自美國Thermo公司；熒光定量PCR循環(huán)儀產(chǎn)自美國ABI公司；Western 電泳儀產(chǎn)自美國BIO-RAD；移液器產(chǎn)自德國eppendorf公司；紫外光度儀產(chǎn)自日本SHIMADZU公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組轉(zhuǎn)染

黑色素瘤A375細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和雙抗(青霉素：100 U/mL;鏈霉素：100 mg/mL)的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱恒溫恒濕培養(yǎng)。隔天換液，細(xì)胞融合度達(dá)75%時(shí)傳代，細(xì)胞傳代3次達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)后取細(xì)胞懸液培養(yǎng)至密度達(dá)到50%～70%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒的構(gòu)建由上海漢恒生物科技有限公司完成。將細(xì)胞分為空白組、NC組、轉(zhuǎn)染組，空白組只轉(zhuǎn)染試劑，NC組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染攜帶目的基因的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染試劑盒室溫平衡20 min，依照試劑盒說明，采用LipofecamineTM2000對A375細(xì)胞按照上述分組轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞裸鼠皮下移植實(shí)驗(yàn)

4～5周齡SPF級BABLc裸鼠18只，雌性，分3組，每組6只。分別收集空白組、NC組、轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸液，濃度為1×107個(gè)/mL，分別以每只0.1 mL接種于3組裸鼠右側(cè)腋窩皮下。每天觀察接種后裸鼠活動及成瘤情況。以皮下結(jié)節(jié)長徑超過0.5 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算成瘤率。成瘤后隔日用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑(L)和短徑(W)，連續(xù)測量21 d。根據(jù)公式計(jì)算腫瘤的體積[7]，繪制生長曲線。腫瘤體積(V)=0.5×L×W2。21 d后處死裸鼠，手術(shù)剝?nèi)∧[瘤進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RT-PCR檢測各基因mRNA的表達(dá)

Trizol法提取各組腫瘤組織中的總RNA,測定RNA濃度及純度，各樣本取5 μL總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成，取2 μL合成產(chǎn)物設(shè)置PCR 擴(kuò)增程序進(jìn)行反應(yīng)，按照一定的順序加入0.1 mL PCR管，一個(gè)樣本基因做3個(gè)復(fù)孔。用SYBR PCR Master Mix對Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin和E-cadheirnmRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，內(nèi)參基因選擇GAPDH。各基因上下游引物(表1)的設(shè)計(jì)及合成由Thermo Fisher公司完成。Real time-PCR擴(kuò)增體系為20 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)40次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在熒光定量操作系統(tǒng)中進(jìn)行分析對比,目標(biāo)基因的相對定量用2-ΔΔCT計(jì)算,ΔΔCt=(Ct實(shí)驗(yàn)-Ct參比)-(Ct對照-Ct參比),Ct為根據(jù)擴(kuò)增曲線確定的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

表1 各基因的上游引物及下游引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 Western blotting檢測各基因蛋白表達(dá)

用RIPA試劑盒提取各組腫瘤組織中總蛋白，用BCA法測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)入NC膜，室溫下用5%的BSA封閉，分別加入相應(yīng)濃度稀釋的單克隆抗體，1 ∶3 000稀釋的GAPDH為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，孵育過夜，用PBS洗滌5次，每次5 min。加入1 ∶5 000雞抗兔IgG二抗，溫育1.5 h，用TBST清洗4次，每次10 min?；瘜W(xué)發(fā)光，顯影，定影。使用G:BOX-chemiXR5成像，采用Gel-Pro32軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析，將各基因和GAPDH比值作為蛋白相對表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1過表達(dá)對A375細(xì)胞裸鼠皮下異種移植瘤生長的影響

經(jīng)5～7 d成瘤潛伏期，3組裸鼠右側(cè)腋窩皮下接種部位均可見直徑大于0.5 cm的腫瘤團(tuán)塊。移植瘤外觀似球形或結(jié)節(jié)狀，質(zhì)地略軟，張力較大，隨著時(shí)間的延長，腫瘤體積逐漸增大，質(zhì)地變硬(圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，3組裸鼠右側(cè)腋窩皮下接種部位可見直徑0.8 cm～1.8 cm的腫瘤團(tuán)塊(圖2)，3組成瘤率均為100%,均未見死亡病例。異種移植瘤的生長情況：在成瘤后5 d內(nèi)，3組腫瘤細(xì)胞生長速度大致相當(dāng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。成瘤第5天起，轉(zhuǎn)染組腫瘤生長速度低于空白組和NC組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.04，P=0.013)，而空白組和NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.52,P>0.05)。

圖1 3組裸鼠皮下異種移植瘤的生長情況Figure 1 Growth of subcutaneous xenograft tumors in the three groups of nude mice.

圖2 成瘤21 d后3組裸鼠皮下異種移植瘤Figure 2 Size of subcutaneous xenograft tumors in the three groups of nude mice after 21 days of tumor formation.

2.2 RT-PCR檢測各基因mRNA的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示(表2)，空白組與NC組比較,各基因mRNA的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)；而相對于空白組與NC組，轉(zhuǎn)染組Beclin1、LC3和E-cadherin的mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)，Vimentin和N-cadherin的mRNA表達(dá)均降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組腫瘤組織中Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin和E-cadheirn的mRNA表達(dá)Table 2 Expression levels of mRNA for Beclin1, LC3Ⅱ, Vimentin, N-cadherin and E-cadheirn in tumor tissues

2.3 Western blotting檢測各基因蛋白表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示(圖3、表3)，空白組與NC組比較,各基因蛋白的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)；而相對于空白組與NC組，轉(zhuǎn)染組Beclin1、LC3Ⅱ和E-cadherin蛋白表達(dá)均升高，Vimentin和N-cadherin蛋白表達(dá)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表3 Western blotting檢測各組腫瘤組織中Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin、E-cadheirn蛋白相對表達(dá)量Table 3 Relative expression levels of Beclin1, LC3Ⅱ, Vimentin, N-cadherin, E-cadheirn proteins in tumor tissues assessed by Western blotting

圖3 Western blotting檢測各組腫瘤組織中Beclin1、LC3Ⅱ、Vimentin、N-cadherin和E-cadheirn的蛋白表達(dá)Figure 3 Expression levels of Beclin1, LC3Ⅱ, Vimentin, N-cadherin and E-cadheirn proteins in each group of tumor tissues assessed by Western blotting.

3 討論

自噬是一種廣泛存在于真核生物中的代謝過程。近年來研究認(rèn)為，自噬在黑素調(diào)節(jié)中亦起著重要的作用，自噬激活劑通過激活自噬-溶酶體途徑誘導(dǎo)黑素小體自噬降解，過表達(dá)Beclin1、 LC3Ⅱ可能通過誘導(dǎo)自噬促進(jìn)黑素合成。近年來自噬對于黑素累積或減少的具體作用機(jī)制正處在研究階段。自噬與腫瘤之間的關(guān)系復(fù)雜，自噬究竟是促進(jìn)還是抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展也尚未定論[8]。Beclin1基因是酵母Atg6的同系物，也是哺乳動物參與自噬的特異性基因。定位于胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Beclin1是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞走向自噬性死亡的重要因子。已有研究證實(shí)，通過上調(diào)Beclin1在結(jié)腸癌以及宮頸癌體外細(xì)胞中的表達(dá)，可使生長周期停滯從而抑制細(xì)胞增殖[9]。黑色素瘤中Beclin1的表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，且與預(yù)后因素有關(guān)[10]。本課題組以往的研究結(jié)果顯示：黑色素瘤SK-MEL-2細(xì)胞株Beclin1蛋白明顯低表達(dá)，Beclin1表達(dá)上調(diào)后可顯著抑制SK-MEL-2細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組和NC組相比，轉(zhuǎn)染組皮下移植瘤生長速度緩慢;21 d后，腫瘤的體積及重量均明顯低于空白組和NC組(P<0.05)。表明過表達(dá)Beclin1可明顯抑制A375細(xì)胞裸鼠皮下異種移植瘤的生長增殖。

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associaled protein 1 light chain 3，LC3)是哺乳動物細(xì)胞中酵母Atg8基因的同源物，同樣是特異性自噬性標(biāo)志蛋白，并在自噬體的形成中發(fā)揮重要的作用[11]。自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3Ⅱ在非小細(xì)胞肺癌及宮頸病變中起協(xié)同抑癌作用[12-13]。本實(shí)驗(yàn)從基因及蛋白水平也證實(shí)過表達(dá)的Beclin1可以促進(jìn)LC3的表達(dá)，二者在黑色素瘤的表達(dá)呈正相關(guān)，提示Beclin1和LC3活性下降或缺失可能參與黑色素瘤的進(jìn)展。

正常組織和腫瘤組織中都存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，上皮細(xì)胞逐漸失去細(xì)胞粘附、緊密連接等表型并獲得間質(zhì)細(xì)胞無極性、可遷移性等表型的過程即為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化EMT[14]。上皮與間質(zhì)細(xì)胞在分子水平也各自表達(dá)特有的標(biāo)志物，如E-cadherin主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，N-cadherin和Vimentin等分子主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞。EMT能使腫瘤細(xì)胞獲得更高的遷移、侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[15]。非小細(xì)胞肺癌組織中E-cadherin低表達(dá)和Vimentin高表達(dá)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起到了重要的調(diào)控作用，是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的一個(gè)特征[16]。自噬可通過腫瘤細(xì)胞表型調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和侵襲[17]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。早期研究表明，自噬與EMT相互聯(lián)系，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中EMT激活的癌細(xì)胞具有高水平的自噬，在多種應(yīng)激條件下存活[18]。自噬基因Beclin1可能以不同的分子機(jī)制在腫瘤上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著“雙重作用”。一方面，細(xì)胞在EMT過程中依賴自噬激活生存，另一方面，自噬起到抑制腫瘤信號的作用，阻礙了轉(zhuǎn)移的早期階段和EMT的激活。因此，通過靶向自噬來調(diào)節(jié)EMT是治療惡性腫瘤的一種非常有前途的策略[19-20]。焦慶麗等[21]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中的Beclin1蛋白水平明顯低于正常乳腺組織，且低表達(dá)的Beclin1可使E-cadherin表達(dá)下調(diào)而 N-cadherin 表達(dá)上調(diào)的 EMT 現(xiàn)象增加，促使乳腺癌的惡性程度增加;進(jìn)一步通過對乳腺癌細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Beclin1可降低甚至逆轉(zhuǎn)其EMT過程。本研究采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)和Western blotting實(shí)驗(yàn)分別從基因水平和蛋白水平檢測Beclin1對黑色素瘤EMT過程的影響,結(jié)果顯示，相對于空白組與NC組，轉(zhuǎn)染組E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，Vimentin和N-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)均降低(P<0.05),證實(shí)Beclin1的過表達(dá)抑制了黑色素瘤EMT的過程，可能進(jìn)而影響腫瘤的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，本研究在動物模型中驗(yàn)證了Beclin1的過表達(dá)可促進(jìn)小鼠黑色素瘤發(fā)生自噬，并抑制腫瘤的生長增殖及EMT過程,Beclin1可能成為治療黑色素瘤的新靶點(diǎn)。但是，本研究未在黑素瘤患者標(biāo)本中檢測Beclin1蛋白的表達(dá)情況，現(xiàn)階段關(guān)于Beclin1調(diào)控自噬對黑色素瘤的具體調(diào)控機(jī)制亦未完全清楚，以后尚需進(jìn)一步全面深入地研究Beclin1在黑色素瘤治療中的作用，以期為研發(fā)黑色素瘤的治療藥物提供新的方向。