蔡昭煒 何少娟 劉容菊 劉華楨

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育齡婦女最常見的生殖內分泌代謝紊亂疾病之一［1］。PCOS 的臨床表現與高雄激素血癥密切相關,同時受多個信號通路及生物機制的調控,如PI3K/AKT 等［2,3］。大量研究已經證實,PCOS 是與胰島素抵抗(IR)存在密切關系的臨床綜合征［4］,在機體發(fā)生胰島素抵抗時,某些相關信號通路被抑制,隨后產生一系列生物反應致使葡萄糖上升。補腎化痰復方是由黃茂、仙靈脾、蒼術、茯苓、丹參、黃連由組成,可用來補腎陰陽、化痰軟堅,主治下丘腦-垂體功能失調而卵巢略大的閉經［5］。目前的研究已顯示該方不僅具備補腎化痰等功能,還具備降血糖、改善卵巢異常癥狀等功能［6］,盡管這樣,其中通路和機理具體的聯(lián)系和效果作用仍需要科研的繼續(xù)探索證實。卵巢顆粒細胞的增殖是多囊卵巢綜合征內分泌代謝紊亂的首要特征［7］,卵巢顆粒細胞的活躍狀態(tài)直接表現了其病癥的嚴重程度,經文獻和前期研究發(fā)現,補腎化痰復方中藥單體能通過抑制相關通路誘導大鼠卵巢顆粒細胞凋亡［8,9］,這也就說明了該方或許能夠影響大鼠卵巢顆粒細胞的增殖情況,通過調控卵巢顆粒細胞的增殖減緩PCOS,其具體的作用效果和生物機制需要進一步的研究。本實驗通過補腎化痰復方干預PCOS 大鼠模型,觀察補腎化痰復方對大鼠內分泌相關生化指標水平變化、胰島素抵抗以及大鼠卵巢顆粒細胞增殖的影響,探究補腎化痰復方是否能夠通過調控胰島素分泌以及抑制卵巢顆粒細胞增殖對PCOS 大鼠產生積極的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 采用陰道涂片篩選出80 只動情周期正常的雌性大鼠,均為SPF 級SD 大鼠,7～8 周齡,體重180～200 g,購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心,該實驗所有處理方法均經過倫理委員會批準。采用隨機數字表法將大鼠分為Ctrl組、PCOS組、低劑量組、高劑量組,每組20 只。

1.2 方法 ①模型構建：所有動物均喂飼普通飼料,正常飲水。每天早上9 點灌胃1 次,PCOS組、低劑量組、高劑量組建立PCOS 大鼠模型,采用來曲唑聯(lián)合高脂乳劑灌服,造模連續(xù)28 d；Ctrl組采用同種方式加入等體積蒸餾水。②干預方式：造模成功后,低劑量組、高劑量組分別給藥補腎化痰復方60、120 mg/kg,PCOS組、Ctrl組采用同種方式加入等體積蒸餾水。③檢測方法：實時監(jiān)測各組大鼠游離脂肪酸、黃體酮、TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平；通過監(jiān)測各組大鼠禁食180 min 血糖變化檢測其胰島素耐量；利用CCK-8 測定各組大鼠卵巢顆粒細胞增殖情況。

CCK-8 測定各組大鼠卵巢顆粒細胞增殖情況具體操作：卵泡液的收集和顆粒細胞的純化方法以密度梯度離心法為基礎,具體步驟如下：①嚴格遵照正確取卵方式,通過穿刺方式得到卵母細胞-放射冠細胞-卵丘細胞復合體,接著整理保存依附著卵巢顆粒細胞的卵泡液；②卵泡液分離：2000 r/min,10 min,半徑11.6 cm,去除上部分液體；③余下液渣和絮亂物則是1 ml 濃度為0.2%的透明質酸酶重懸,37℃水浴溫熱20 min；④沉淀物捏聚,并小心穩(wěn)定地轉移到已備好的15 ml 無菌離心管,離心管已做好預備工作(加入4 ml淋巴細胞分離液),2000 r/min,10 min,半徑11.6 cm；⑤中央白灰色固態(tài)懸浮物細胞團便是顆粒細胞,用針管抽取到1.5 ml 離心管中,再用1×PBS 溶液清洗1 遍,-80℃永久保存。收集上述細胞后,進行試驗的分組：正常組、補腎化痰復方低、中、高組。正常組給予含0%含藥血清RPMI-1640 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,補腎化痰復方低、中、高組分別給予濃度為含20%、40%、80%含藥血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)后的PCOS大鼠卵巢顆粒細胞(104個細胞/孔)接種到96 孔板中,然后用不同濃度的PB2 (0、10、20、50、100 μM)處理48 h。接下來,依照CCK-8 法來進行細胞增值活性程度計算。將10 μl CCK-8 溶液轉移至96 孔板的所有板孔。溫育3 h,經酶標儀450 nm 檢測細胞反應強度。

1.3 觀察指標 比較四組大鼠游離脂肪酸、黃體酮、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平；禁食不同時間后ITT值；不同劑量補腎化痰復方組大鼠卵巢顆粒細胞增殖情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計學軟件對研究數據進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數±標準差()表示,采用單因素方差分析或秩和檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組大鼠游離脂肪酸、黃體酮、TC、TG、LDL-C和HDL-C 水平比較 PCOS組大鼠黃體酮、HDL-C 水平顯著低于Ctrl組,游離脂肪酸、LDL-C、TC、TG 水平高于Ctrl組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。低劑量組黃體酮高于PCOS組,游離脂肪酸、LDL-C 低于PCOS組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；低劑量組TC、HDL-C 和TG 水平與PCOS組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。高劑量組黃體酮、HDL-C 水平高于PCOS組,游離脂肪酸、LDL-C、TC、TG 水平低于PCOS組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1,圖1～4。

表1 四組大鼠游離脂肪酸、黃體酮、TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平比較()

表1 四組大鼠游離脂肪酸、黃體酮、TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平比較()

注：與Ctrl組比較,aP＜0.05；與PCOS組比較,bP＜0.05

2.2 四組大鼠禁食不同時間后ITT 值比較 四組大鼠禁食不同時間后ITT 值比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；禁食30 min,四組大鼠ITT 值均下降,低劑量組、Ctrl組大鼠ITT 值下降到最低值,而PCOS組則是禁食60 min 才達到最低值,之后開始增高；高劑量組禁食90 min ITT 值達到最低值,之后開始增高。在相同時間點,PCOS組大鼠ITT 值均高于Ctrl組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；高、低劑量組ITT 值與Ctrl組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；且高劑量組的ITT 值隨時間的變化幅度相較于低劑量組而言更小。見表2,圖5。

表2 四組大鼠禁食不同時間后ITT 值比較(,mmol/L)

表2 四組大鼠禁食不同時間后ITT 值比較(,mmol/L)

注：與Ctrl組比較,aP＜0.05

2.3 不同劑量補腎化痰復方組大鼠卵巢顆粒細胞增殖情況比較 0 μM組、10 μM組、50 μM組和100 μM組大鼠卵巢顆粒細胞相對活性分別為(91.00±11.36)%、(63.33±8.74)%、(53.00±11.79)% 和(41.00±14.11)%,比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；10 μM組、50 μM組和100 μM組大鼠卵巢顆粒細胞相對活性明顯低于0 μM組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),并且隨著劑量梯度升高,下降越顯著。見圖6。

3 討論

補腎化痰復方是結合中醫(yī)婦科理論所總結的治療脾腎陽虛痰濕型PCOS 的經驗方。前期的研究和大量文獻證明,補腎化痰復方與PCOS 大鼠的信號通路相關,并且經通路調控胰島素分泌和抑制卵巢顆粒細胞增殖,對PCOS 有著積極的緩解作用［10-12］,但這些方面目前沒有動物實驗證實。

PCOS 是國內研究的重心,近年來國內越來越多的研究人員傾向將中醫(yī)辨證思想融入頑疾的診治中,而國外卻鮮有用中藥治療PCOS 的實驗或研究。本實驗首次證明了PCOS 大鼠在補腎化痰復方的干預下,血清中的游離脂肪酸、黃體酮水平、TC、TG、LDL-C 和HDL-C 異常表達均得到緩解。在PCOS 大鼠中,黃體酮水平、HDL-C 和TG 的表達水平異常低,而游離脂肪酸水平、LDL-C 和TC 的水平異常高,說明了PCOS影響了大鼠的內分泌情況,使大鼠的多項生化指標處在一個異常的情況。而在補腎化痰復方的干預下,這些生化指標均向正常大鼠的標準值靠近,這說明了補腎化痰復方緩解了PCOS 內分泌的異常,使游離脂肪酸、LDL-C、TG 和TC 分泌降低,黃體酮、HDL-C 分泌增加。證實了補腎化痰復方可能有調整大鼠內分泌穩(wěn)定的效果［13,14］。而在本實驗的胰島素耐量研究中,證實了補腎化痰復方顯著改善了PCOS 大鼠的胰島素耐量,具體表現為補腎化痰復方組的ITT 值隨時間的變化趨勢相較于PCOS組更穩(wěn)定。這說明了PCOS 影響了大鼠的胰島素抵抗能力,使胰島素耐量處于不穩(wěn)定的狀態(tài),而補腎化痰復方能夠改善PCOS 大鼠的胰島素抵抗異常情況。補腎化痰復方調控胰島素分泌緩解PCOS 的理論具有極大可能,但確切的證明仍需要進一步研究。卵巢顆粒增殖情況與補腎化痰復方的關系也在本實驗中被證實,在不同濃度的補腎化痰復方干預下,PCOS 大鼠的卵巢顆粒增殖得到明顯抑制。證實了抑制卵巢顆粒細胞增殖活性極可能是補腎化痰復方緩解PCOS 的途徑之一,但具體的證明也需要下一步的研究。

綜上所述,大鼠患上PCOS 后體內激素分泌異常、生理行為異常、胰島素分泌不足,導致卵巢顆粒增殖行為異?；钴S,而補腎化痰復方可能通過調控胰島素分泌改變其胰島素抵抗情況,并通過抑制其卵巢顆粒細胞增殖來改善生理活動異常。補腎化痰復方在PCOS中發(fā)揮著很大的作用,作為其特效藥有潛在的可能性和巨大的研究價值,以調控胰島素和抑制卵巢顆粒細胞治療PCOS 有一定的可行性,其具體作用機理有待研究。